什麼是多片段dna無縫連接

A. DNA的片段之間有哪些連接

（1）具互補黏性末端片段之間的連接：連接反應可用emphasis：role=italicE.coliemphasis：DNA連接酶，也可用T4：DNA連接酶。待連接的兩個DNA片段的末端如果是用同一種限制性內切核酸酶酶切的，連接後仍保留原限制性內切核酸酶的識別序列。如果是用兩種同尾酶酶切的，雖然產生相同的互補黏性末端，可以有效地進行連接，但是獲得的重組DNA分子往往消失了原來用於酶切的那兩種限制性內切核酸酶的識別序列。

（2）具平末端DNA片段之間的連接：連接反應必須用T4：DNA連接酶。只要兩個DNA片段的末端是平末端的，不管是用什麼限制性內切核酸酶酶切後產生的，還是用其他方法產生的，都同樣可以進行連接。如果用兩種不同限制性內切核酸酶酶切後產生的平末端DNA片段之間進行連接，連接後的DNA分子失去了那兩種限制性內切核酸酶的識別序列。如果兩個DNA片段的末端是用同一種限制性內切核酸酶酶切後產生的，連接後的DNA分子仍保留那種酶的識別序列，有的還出現另一種新的限制性內切核酸酶識別序列。

（3）DNA片段末端修飾後進行連接：待連接的兩個DNA片段經過不同限制性內切核酸酶酶切後，產生的末端未必是互補黏性末端，或者未必都是平末端，因此無法進行連接。在這種情況下，連接之前必須對兩個末端或一個末端進行修飾。修飾的方式主要是採用核酸外切酶Ⅶ（exonuclease：Ⅶ，Exo：Ⅶ）將黏性末端修飾成平末端；採用末端脫氧核苷酸轉移酶（簡稱末端轉移酶）將平末端修飾成互補黏性末端。有時為了避免待連接的兩個DNA片段自行連接成環形DNA，或自行連接成二聚體或多聚體，可採用鹼性膦酸酯酶將其中一種DNA片段5′-P修飾成-OH。

（4）DNA片段加連桿後連接：如果要連接既不具互補黏性末端又不具平末端的兩種DNA片段，除了上述用修飾一種或兩種DNA片段末端後進行連接的方法外，還可以採用人工合成的連桿（linker）或銜接頭（adaptor）。先將連桿連接到待連接的一種或兩種DNA片段的末端，然後用合適的限制性內切核酸酶酶切連桿，使待連接的兩種DNA片段具互補黏性末端，最後在DNA連接酶催化下使兩種DNA片段連接，產生重組DNA分子。此外，也可以根據兩DNA片段的末端，選用合適的銜接頭直接把兩DNA片段連接在一起。

B. 生物科學中的連接在DNA兩端的雙鏈接頭是什麼

就是人工向片段兩端加的小片段DNA。接頭的序列是可以自己設計的，來達到一定的目的。在抑制PCR中就是靠連接接頭來達到擴增目的片段而抑制非目的片段擴增的。

C. 質粒系列之再談無縫連接--Gibson assembly

每次都想要一篇文章的篇幅講完，但知識總是越學越知道自己的無知，於是每次就像打補丁一樣這里打一下那裡打一下，導致文章都不成系列，十分鬆散。關於Gibson assembly其實我之前也講過，只是都不記得放在哪一篇里了。這是最近學習的筆記。

限制性克隆所謂成也限制性，敗也限制性，限制性克隆的最大的限制來源於其「限制性。Gibson assembly不依賴限制性內切酶，可一步完成多個DNA序列的組裝，大大提升DNA組裝速率，同時還可降低載體自連的概率，是多片段DNA序列連接的首選方式。下表簡單比較兩種方法的特點。

這查資料的時候發現特別有趣，原來無論是限制性克隆還是Gibson assembly，都是出自同一個實驗室/機構。

左邊這位 Hamilton Smith 教授是II類限制性內切酶的發現者之一，並因這一發現與Daniel Nathans和Werner Arber共同獲得了1978年的諾貝爾生理學和醫學獎。而右邊的 Daniel Gibson 於2004年到 J. Craig Venter Institute (克雷格·文特爾研究所 )的 Hamilton Smith組做博後，負責細菌基因組合成的相關課題。而 J. Craig Venter 則因其牽頭人類基因組計劃而聞名，創立了 J. Craig Venter Institute 及 Synthetic Genomics Inc. ( SGI ) 公司

從2004年Gibson入職到2008年，不到4年時間，Gibson和Smith在 Science 上共同發表了酵母細胞完成支原體基因組組裝的文章，而這篇文章用到的DNA片段組裝方法則在2009年發表於 Nature Methods

從上圖Nature Methods文章的摘要可看到，Gibson使用 5『核酸外切酶，DNA聚合酶和DNA連接酶 完成了多DNA片段的一步連接，而這就是我們現在常用的 Gibson assembly 。

一般實驗室都直接購買配好的Gibson assembly mixture，但也可自行購買T5 核酸外切酶、DNA聚合酶以及DNA連接酶配置。Gibson操作簡單，具體過程和步驟都寫在下圖中：

需要注意的事項有：

(1) 一般說明書推薦所有片段都用PCR手段獲得，但長片段會有因PCR而引入突變，因此，骨架大片段可採用限制性內切酶處理後獲取。

(2) 如果兩端序列中有多個同源序列，則會有錯誤同源重組的可能，例如Loxp序列等等。

對比限制性克隆和Gibson assembly，最大的區別是無需特定的酶切位點，然而實際上還是需要overlap的懸端，只是這個懸端可以由PCR帶來，同時核酸外切酶的末端修整，使得overlap序列暴露，從而完成同源重組。那麼核酸內切酶和核酸外切酶的差別和分類我們可以簡單來學習一下：

從名字來看，內切酶切的是序列內部，外切酶切的則為外部（5』或3『末端），具體的比較可如下表：

兩種方法自是各有優缺，雖目前多用Gibson assembly，但限制性克隆仍然常用。限制性內切酶種類繁多，其中Type IIS克隆更是被稱為 Golden Gate cloning 。從操作時間來看，Golden Gate是最簡單的方法之一，單管內酶切和連接可在30分鍾內完成。由於Type IIS酶切不保留酶的識別位點，因此連接產物的形成是不可逆的，連接效率幾近100%。且Golden Gate 克隆限制性克隆需分步完成的缺點，在同一管內可完成多達10個片段的連接，果子老師稱之為-- 質粒改造的王者 。下周，我們將會聊聊這 Golden Gate cloning ，敬請期待。

D. chew back啥意思

不知道是不是DNA連接方面的，Chew-back是一種DNA的組裝方式。
單鏈退火拚接技術，即所謂的Chew-back組裝，是指創造DNA分子之間的重疊區，通過連接或聚合的思想實現分子間的拼接。這種技術既跳出了限制酶的使用，利用DNA外切酶產生了較長的黏性末端；又應用等級化組裝模式很好地規避了逐級添加的耗時耗力與一次性組裝可能不正確的拼接，使得無論在組裝的DNA片段數目還是尺度上變得更為高效。例如目前最常用的Gibson
assembly和SLIC技術。
在2008年，Gibson等在構建生殖道支原體基因組時，首先採用自創的體外變溫兩步組裝法獲得了支原體1/4大小基因組，然後對該技術進行改進，將這4個超過100
kb的片段在體外組裝成了完整的583 kb的生殖支原體基因組。2010年，Gibson研究組又通過條件優化將600個帶有20 bp重疊序列的60
bp的寡核苷酸在體外成功人工組裝合成了16.3 kb的小鼠線粒體基因組。

由此可見，Gibson拼接技術可以簡單快速地實現多個DNA片段的一次性無縫組裝，而且組裝尺度非常可觀，現已成功組裝的最大的DNA分子大小為1.08
Mb。但是隨著一次組裝的DNA片段的增多，其效率和正確率也會隨之降低，而且需要的重疊序列也較長，引物合成的費用也相應增加。
SLIC是一種不依賴於序列和連接反應的克隆方法，主要利用T4
DNA聚合酶在無dNTPs存在的情況下發揮3′→5′核酸外切酶活性，將DNA片段消化產生含有末端重疊序列的5′黏性末端，然後DNA片段之間或DNA片段與載體之間依靠重疊序列退火(Rec
A可提高重組效率)，形成環狀中間體，最後直接轉化大腸桿菌感受態細胞，利用大腸桿菌本身的修復系統修復成完整的環狀重組質粒
。2009年，美國哈佛醫學院的StephenElledge研究組利用SLIC實現了9個含40 bp末端重疊序列的DNA片段(275-980
bp)的一步拼接。
SLIC拼接法不需要連接酶，也不需要考慮插入的DNA片段本身的序列，可以實現多個DNA片段的一次性組裝，是構建生物合成途徑的一個有效技術。目前，國外許多公司已經將其商業化，例如Novagen公司的RadianceTM系統和Invitrogen公司的GatewayTM系統都是基於此技術開發出來的。相對於上述Gibson
assembly技術而言，SLIC只需要一種酶(T4 DNA聚合酶)即可完成多片段組裝，而Gibson
assembly則需要T5核酸外切酶、DNA聚合酶及Taq連接酶的協同作用。但是該技術只能組裝中等尺度的DNA片段，而Gibson
assembly則可以組裝高達580 kb的DNA大片段。

此外，In-FusionTM Cloning也是一種與SLIC類似的不依賴於連接反應的組裝技術，不同的是In-FusionTM
Cloning使用的是一種功能類似的牛痘DNA聚合酶而非T4 DNA聚合酶，而且它只需要15 bp的重疊序列，而SLIC則需要至少40 bp的重疊序列。目前Gibson有商業化的試劑盒。
詳細內容可見網址：
http://journals.im.ac.cn/html/wswxtbcn/2015/11/tb15112229.htm

E. 到底什麼是DNA片段

DNA是遺傳物質，它主要以DNA鏈的形式存在，被水解之後會得到很多大小不一的片段，就稱為DNA片段。
由A、T、C、G是四種組成DNA的脫氧核苷酸。

F. 如何設計無縫克隆法能將同時兩個dna片段插入載體的引物

目的mRNA在細胞中的含量占細胞質總mRNA量的0.5%以下.
5,mRNA的富集方法
典型的哺乳動物細回胞含有10,000-30,000種不同的答mRNA分子,某些mRNA分子在細胞內的拷貝數很低甚至只有一個拷貝.
mRNA的豐度與文庫克隆子數的關系
ln(1-P)
N= ln(1-1/n)
N: 所需克隆數; P: 要求的概率; n:一種mRNA在總mRNA中的相對比例
1) 按大小對mRNA進行分級分離
* 通過瓊脂糖凝膠電泳分離大小不同的mRNA分子,該方法的分離效果最好,但從凝膠中回收的得率較低.
* 蔗糖梯度離心:加入破壞RNA二級結構的變性劑如氫氧化甲基汞等,再進行蔗糖梯度離心以分離不同分子量的mRNA.

G. DNA連接酶的連接手段

目前已知有三種方法可以用來在體外連接DNA片段：
第一種方法是，用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片段；
第二種方法是，用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核苷酸轉移酶給具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之後，再用DNA連接酶將它們連接起來；
第三種方法是，先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之後，再用DNA連接酶將它們連接起來。這三種方法雖然互有差異，但共同的一點都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。
粘性末端DNA片段的連接
DNA連接酶最突出的特點是，它能夠催化外源DNA和載體分子之間發生連接作用，形成重組的DNA分子。
平末端DNA片段的連接
常用的平末端DNA片段連接法，主要有同聚物加尾法、銜接物連接法及接頭連接法。
同聚物加尾法
這種方法的核心部分是，利用末端脫氧核苷酸轉移酶轉移核苷酸的特殊功能。末端脫氧核苷酸轉移酶是從動物組織中分離出來的一種異常的DNA聚合酶，它能夠將核苷酸（通過脫氧核苷三磷酸前體）加到DNA分子單鏈延伸末端的3′-OH基團上。由核酸外切酶處理過的DNA，以及dATP和末端脫氧核苷酸轉移酶組成的反應混合物中，DNA分子的3′-OH末端將會出現單純由腺嘌呤核苷酸組成的DNA單鏈延伸。這樣的延伸片段，稱之為poly（dA）尾巴（圖2-7）。反過來，如果在反應混合物中加入的是dTTP，那麼DNA分子的3′-OH末端將會形成poly（dT）尾巴。因此任何兩條DNA分子，只要分別獲得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就會彼此連接起來。這種連接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴連接法（homopolymertail-joining），簡稱同聚物加尾法。
銜接物連接法
所謂銜接物（linker），是指用化學方法合成的一段由10～12個核苷酸組成、具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。銜接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端，用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然後再通過T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來。接著用適當的限制酶消化具銜接物的DNA分子和克隆載體分子，這樣的結果使二者都產生出了彼此互補的粘性末端。於是我們便可以按照常規的粘性末端連接法，將待克隆的DNA片段同載體分子連接起來。
DNA接頭連接法
DNA接頭，是一類人工合成的一頭具某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之後，便會使後者成為具粘性末端的新的DNA分子，而易於連接重組。實際使用時對DNA接頭末端的化學結構進行必要的修飾與改造，可避免處在同一反應體系中的各個DNA接頭分子的粘性末端之間發生彼此間的配對連接。

H. 基因片段用什麼拼接怎樣拼接

粘性末端法,又稱限制性內切酶酶切法。要求兩種DNA分子具備同一個限制性內切酶切點,能產生互補的粘性末端。主要缺點是較難選擇重組質粒,而且當外源DNA片段的長度超過載體DNA較多時,形成的重組質粒的轉化率較低

I. 如何拼接DNA序列

用DNA連接酶將雙鏈DNA分子片段「縫合」起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，當磷酸二酯鍵恢復後，氫鍵會自動形成。
E·coli-DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來。T4-DNA連接酶可以縫合兩種末端（黏性末端和平末端），但連接平末端之間的效率較低。
（註：部分資料摘自《直通高考》）