Ⅰ 無縫克隆引物不含酶切位點設計原理
無縫克隆，讓載體構建變得像搭積木一樣簡單
吳思涵
知芹余擾識星球「生物狗窩」，生物醫學同行交流社區
前言
提起「克隆」、「載體構建」這兩個詞，似乎總會同時提到「限制性內切酶」。沒錯，在過去數十年，用限制性內切酶產生黏性末端，並通過鹼基互補配對，連接兩個甚至更多片段的克隆方法，是載體構建的經典方案。
近年嫌旦來，「無縫克隆」逐漸受到科學家的歡迎。相比之下，無縫克隆操作更加簡單，靈活性更強，同時幾乎不受序列的限制，一次可定向組裝高達10個片段的dsDNA。這篇文章將帶大家認識無縫克隆的原理、優勢和應用。
一、無縫克隆的原理
首先要強調的是，無縫克隆有兩個主要的流派：Gibson assembly和Golden Gate assembly。由於Golden Gate assembly依賴於Type IIS限制性DNA內切酶（如BsaI，BbsI等），一旦載體不攜帶相應的識別序列，這種方法就走不通了。而假設通過PCR引入Type IIS內切酶識別序列，那便不是真毀宴正意義上的「無縫」了。因此本文所提的「無縫克隆」，特指Gibson assembly流，不涉及任何Golden Gate及其他流派。
目前，無縫克隆比較著名的商品化名字有NEB家的Gibson Assembly和NEBuilder HiFi DNA Assembly，Clontech家的In-Fusion，以及Invitrogen家的GeneArt等。但無論叫什麼名字，其基本原理都和早期的Gibson assembly的是一樣的。
與傳統的雙酶切克隆一般，無縫克隆同樣需要依賴於dsDNA的黏性末端進行互補配對，並利用DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵修復缺口（nick）。但是，無縫克隆並不使用「內切酶」來製造黏性末端，而是通過「外切酶」來產生的。
（Tips 1：「內切酶」是在核酸鏈內部進行「一刀兩斷」剪切的酶，而「外切酶」是在核酸鏈的末端、即外部進行「逐個鹼基」剪切的酶）
在無縫克隆中使用的外切酶是T5核酸外切酶，它能沿著5』→3』方向，降解dsDNA，從而產生黏性末端。
（Tips 2：T5外切酶同時具有ssDNA外切酶活性，但並不降解超螺旋dsDNA。）
讀到這里大家應該能想到，假設要拼接的兩個片段的末端，是一模一樣的鹼基序列，那麼通過T5外切酶，就能產生幾乎一致的黏性末端了。沒錯，無縫克隆的原理便是如此。如下圖所示，假如我們需要將3個片段按照1→2→3的順序拼接起來，只需要保證1的末尾和2的開頭，以及2的末尾和3的開頭，具有同樣的序列即可（我們可稱之為同源臂）。這個同源臂序列，並不是額外添加進去的，而是載體或者拼接片段本身攜帶的。也就是說，我們可以通過PCR的方法，在外源拼接片段的兩端加上線性化載體
Ⅱ 🔬實驗 | 分子克隆實驗——無縫克隆
無縫克隆原理
在載體末端和引物末端應具有15-25個同源鹼基（同源臂）。通過T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶，三種酶同時發揮功能，從而達到單片段或多片段與載體連接的技術。
T5核酸外切酶：5『→3』端消化DNA片段，形成粘性末端；DNA聚合酶：填補缺口；DNA連接酶：兩條DNA 單鏈黏合起來。
無縫克隆特點
對比傳統分子克隆與無縫克隆的實驗流程
1. 載體制備
載體的線性化：酶切（單酶切、雙酶切）或反向 PCR 擴增。
酶切制備推薦雙酶切方法進行，單酶切則需要去磷酸化；酶切完成後，需失活快速內切酶或將產物進行純化。
反向 PCR 擴增制備線性化載體需設計載體末端引物，推薦使用高保真 PCR Mix 進行擴增，使用預線性化的質粒作為模板。
2. 插入片段制備
引物設計原則：使用PCR擴增方法獲得目的片段，引物5' 端需包含與其相鄰片段末端同源的15~25nt（推薦18nt），以保證擴增產物的5' 端和3' 端分別與相鄰片段形成重疊序列。
插入片段正反向擴增引物設計：正向引物包含載體末端正向同源序列、酶切位點和基因特異性序列；反向引物包含基因特異性序列、酶切位點和載體末端反向同源序列。
製作最終序列圖譜，可使用在線設計工具或SnapGene軟體。
3. 無縫克隆體系配製與反應
計算最適載體和片段用量，注意長度影響。體系反應需在50℃進行，反應時間5~60min，然後離心冷卻，准備轉化或儲存。
4. 轉化與克隆篩選
轉化感受態細胞，將重組產物與細胞混合，42℃熱激後置於37℃培養，菌落PCR或酶切法鑒定。
實驗注意事項
推薦使用高效率感受態細胞進行轉化，避免使用未純化PCR擴增產物，以質粒為模板進行PCR擴增後，使用 DpnI 消化處理時需失活 DpnI，以避免降解重組載體。