『壹』 無縫克隆引物不含酶切位點設計原理
無縫克隆，讓載體構建變得像搭積木一樣簡單
吳思涵
知芹余擾識星球「生物狗窩」，生物醫學同行交流社區
前言
提起「克隆」、「載體構建」這兩個詞，似乎總會同時提到「限制性內切酶」。沒錯，在過去數十年，用限制性內切酶產生黏性末端，並通過鹼基互補配對，連接兩個甚至更多片段的克隆方法，是載體構建的經典方案。
近年嫌旦來，「無縫克隆」逐漸受到科學家的歡迎。相比之下，無縫克隆操作更加簡單，靈活性更強，同時幾乎不受序列的限制，一次可定向組裝高達10個片段的dsDNA。這篇文章將帶大家認識無縫克隆的原理、優勢和應用。
一、無縫克隆的原理
首先要強調的是，無縫克隆有兩個主要的流派：Gibson assembly和Golden Gate assembly。由於Golden Gate assembly依賴於Type IIS限制性DNA內切酶（如BsaI，BbsI等），一旦載體不攜帶相應的識別序列，這種方法就走不通了。而假設通過PCR引入Type IIS內切酶識別序列，那便不是真毀宴正意義上的「無縫」了。因此本文所提的「無縫克隆」，特指Gibson assembly流，不涉及任何Golden Gate及其他流派。
目前，無縫克隆比較著名的商品化名字有NEB家的Gibson Assembly和NEBuilder HiFi DNA Assembly，Clontech家的In-Fusion，以及Invitrogen家的GeneArt等。但無論叫什麼名字，其基本原理都和早期的Gibson assembly的是一樣的。
與傳統的雙酶切克隆一般，無縫克隆同樣需要依賴於dsDNA的黏性末端進行互補配對，並利用DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵修復缺口（nick）。但是，無縫克隆並不使用「內切酶」來製造黏性末端，而是通過「外切酶」來產生的。
（Tips 1：「內切酶」是在核酸鏈內部進行「一刀兩斷」剪切的酶，而「外切酶」是在核酸鏈的末端、即外部進行「逐個鹼基」剪切的酶）
在無縫克隆中使用的外切酶是T5核酸外切酶，它能沿著5』→3』方向，降解dsDNA，從而產生黏性末端。
（Tips 2：T5外切酶同時具有ssDNA外切酶活性，但並不降解超螺旋dsDNA。）
讀到這里大家應該能想到，假設要拼接的兩個片段的末端，是一模一樣的鹼基序列，那麼通過T5外切酶，就能產生幾乎一致的黏性末端了。沒錯，無縫克隆的原理便是如此。如下圖所示，假如我們需要將3個片段按照1→2→3的順序拼接起來，只需要保證1的末尾和2的開頭，以及2的末尾和3的開頭，具有同樣的序列即可（我們可稱之為同源臂）。這個同源臂序列，並不是額外添加進去的，而是載體或者拼接片段本身攜帶的。也就是說，我們可以通過PCR的方法，在外源拼接片段的兩端加上線性化載體
『貳』 掌握這些技術，基因克隆不是夢
在過去的幾十年裡,分子生物學家已經開發許多可以用來更快地構建目的DNA序列結構的技術來簡化和規范克隆過程。
你熟悉這些克隆技術嗎?下面我們來看看這些技術的特點。
1, 限制性酶切與連接法
長期以來，限制酶切與連接法被認為是一種傳統的克隆方法。這個方法便宜靈活，可以分為兩步過程：酶切和連接。限制性內切酶能特異地結合於一段被稱為限制性酶識別序列的DNA片段上並切割雙鏈DNA。DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5』-磷酸和3』-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中，最有用的DNA連接酶是來自T4噬菌體的DNA 連接酶：T4 DNA連接酶。這個方法原理較簡單，我不做過多介紹。
2, Gateway 克隆技術
Gateway克隆發明於九十年代末，由walhout[2]等提出，一種通用性的克隆方法，與傳統克隆方法相比，Gateway技術的優點是可以不必考慮目的DNA 是否有合適的酶切位點，也不必進行繁瑣而費時費力的酶切和連接反應，就可以按確定的方向和讀碼框快速而准確地將目的基因克隆到各種與Gateway技術兼容的目的載體上。
它利用λ噬菌體與大腸桿菌染色體之間發生的位點特異性的重組整合與切除反應，即LR和BP。BP反應是利用一個attB DNA片段或表達克隆和一個attP供體載體之間的重組反應，創建一個入門克隆。LR 反應是一個attR入門克隆和一個attR目的載體之間的重組反應。LR反應用來在平行的反應中轉移目的序列到一個或多個目的載體。重組位點attB、attP、attL和attR 由噬菌體λ和大腸桿菌編碼的酶合劑特異識別。
Invitrogen公司開發了包括運用於原核、酵母、昆蟲和哺乳動物等不同宿主的表達載體，大大提高了Gateway技術的適用性。Gateway技術已被廣泛用於高通量載體的構建
3, Gibson Assembly
傳統的限制性內切酶克隆技術，會在兩個片段的結合位置上形成一道「疤」或「縫」，這種瑕疵可能會對DNA片段的行為產生微妙的影響。這一點特別令合成生物學家頭疼，因為他們常常要將啟動子和終止子這樣的DNA片段轉變為可預測的獨立元件。Now我給大家介紹一下Gibson Assembly，一種無縫克隆方法。
Gibson組裝最早由Daniel Gibson博士和他的同事J. Craig Venter在2009年提出[3]。Gibson組裝非常適合用於拼接多個線性DNA片段，當然也適合將目的DNA插入載體中。如下圖所示，首先，需要在DNA片段的末端加上同源片段（通過PCR法加上）；然後，將這些DNA片段和一種master mix（含有三種酶）混合孵育一個小時就可以了。這種master mix含有三種不同類型的酶：1）一種外切酶，從5』端開始對DNA進行消化，產生長的黏性末端，這樣便於與另外的同源末端進行配對結合。2）一種聚合酶，用於修補gap。3）一種DNA連接酶，實現無痕拼接，形成完整的DNA分子。
這個系統最厲害的是，這三種酶都可以在同一個溫度下很好的發揮功能，所以整個反應在50攝氏度條件下一個小時就可以完成。一小時後，樣品可以直接用於轉化。當然Gibson Assembly也有缺陷，這一過程並沒有生成限制性酶切位點，因而不方便將拼接片段轉移到另一個載體上。建議最好是事先設計好限制性位點。需要注意的是，如果一次性組裝超過5個片段，成功率會大大降低。
4, Golden Gate 拼裝法
Golden Gate 拼裝法主要是依賴於一種II型限制性內切酶(ⅡS 型酶，如 BsaⅠ和 AarⅠ)，這種酶能夠在其DNA 識別處的相鄰位置進行剪切[4]。如果人為設計識別位點不同的相鄰序列，就可利用同種限制酶產生不同的粘性末端，從而一次組裝多個片段，這克服了傳統多片段組裝時限制酶種類的限制。
具體到原理：一般的內切酶分為三種，通常用的是2類的酶，識別特定的迴文序列，並從中切開。而golden gate一般用的是3類酶，一般以bsmb 1，Bsa1, Bbs1這三種酶，識別特定的序列，並在特定序列以後隔幾個任意的鹼基切開，這樣子就可以克服2類酶必須要迴文序列才能用的缺點，實現片段的連接。
另外，要說的是連接部分，傳統的連接酶是T4用的比較多，T4可以連接黏性末端跟平末端，而golden gate里用的是T7，它的特點是只能實現連接黏性末端。因為T7的這一特性，所以在連接的時候可以把片段跟切好的載體混到一種特殊的buffer里，在這里內切酶跟T7都可以保持比較高的活性，通過溫度的調節，實現克隆的構建。因為用的是T7，所以不用擔心PCR片段自連降低克隆效率，又因為是用的三類酶，可以通過黏性末端的設計，可以一種酶切多個片段，又不用擔心這幾個片段之間的亂連，來達到分子克隆的目的[5]。
5, TOPO克隆(TA克隆)
TOPO克隆使用DNA拓撲異構酶I，該酶同時具有限制酶和連接酶的特性。這種酶在復制期間切割並重新連接DNA，整個克隆過程可以在室溫下完成，且僅需5分鍾。TOPO克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需在PCR擴增產物上加接頭，即可直接進行克隆。
Topo TA克隆原理與TA克隆一樣，唯一不同的是TA克隆用的是T4連接酶把PCR片斷連接到T載體上，而Topo TA Cloning用的是DNA 拓撲異構酶I。
pCR-TOPO 載體也是一種 T 載體，只是在其 3』末端的突出 T 上共價結合了一個拓撲異構酶 Ⅰ ，當帶 3′ 末端的突出 A 的 PCR 產物與該 T 載體互補配對時，拓撲異構酶 Ⅰ 就將該缺口連接起來。
自沃森，克里克在1953年發現DNA雙螺旋結構不過60餘年，如今的DNA克隆技術卻已發展到如此的程度。合成生物學正處在高速發展時期，這些進步技術的進步必將推動生物革命浪潮的到來。你都掌握了嗎？
Reference
[1] 李華琴,林陳水,張文倩. 不依賴連接反應的高通量克隆方法. 氨基酸和生物資源.2013,35(4):43-46
[2] Walhout A J M, Temple G F, Brasch M A, et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes[J]. Methods in enzymology, 2000, 328: 575-IN7.
[3] Gibson, D.G., et al. (2009) Nat. Methods 6, 343-345.
[4] Morbitzer R, Elsaesser J, Hausner J, et al. Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by molar cloning[J]. Nucleic acids research, 2011, 39(13): 5790-5799.
[5] https://www.hu.com/question/49568914/answer/116646832
『叄』 DNA克隆概念
應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質——同源或異源、原核或真核、天然或人工的DNA與載體DNA相結合成一具有自我復制能力的DNA分子—散態—漏廳復制子，繼沖搜源而通過轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆。
『肆』 什麼是基因克隆
基因克隆即重組DNA技術,指在體外對DNA分子按照既定族閉旦的目的和方案,採用酶學方法將不同來源的DNA分子在體外剪切和重新連接,組裝成一個新的DNA分子.在此基礎上,將這個DNA分子導入到一定的宿主細胞,使它能夠在宿主細胞中擴增,形成大量的子代分子,此兆擾過程即稱為基因克隆.基因克隆包括四個基本技術環態鎮節:
『伍』 SnapGene軟體教程之分子克隆功能&技術原理
最近在做克隆載體，入手了一款非常好用的軟體 SnapGene 。網上教程挺多的，其中最推崇 四方居士 的 視頻教程 ，在優酷上可以直接觀看。
這款軟體用來繪制圖譜，編輯序列，設計引物，重組克隆都非常方便。對於克隆，在軟體的Action工具欄內除了常規的限制性酶切插入克隆 ，PCR等常規操作，還列出了5種成熟的商業化的 無縫克隆 供使用者選擇。這5種克隆技術分別是：
<!> 本文作為觀後筆記，將四方居士講解的克隆技術的原理進行文字記錄和整理，以便收藏和分享。更多內容，請大家一定去觀看四方居士的視頻教程！
PCR是所有分子生物學實驗的基礎，全稱為聚合酶鏈式反應，通過高溫變性，退火和延伸反應三部曲來擴增目的DNA序列。通過引物的設計變化，擴增反應的組合，特殊酶的使用等等，基礎的PCR反應可以有千萬種變化。下面介紹兩種在克隆構建中經常會被用到的PCR方法。
不論變種PCR設計得多麼復雜，只要畫成示意圖，就能一目瞭然。真是一圖抵千言。
如圖所示，重疊延伸PCR中的「重疊」指的就是兩組PCR的產物，通過引物引入一段相同的序列。這段相同的序列，使得兩組PCR產物的單鏈能夠在退火時結合，這種雜交產物在DNA聚合酶的幫助下延伸成完整的DNA雙鏈。再通過最兩端的引物對融合的長篇段DNA進行擴增。
需要注意的是，引物設計時引入的「重疊」序列是反向互補配對的。
重疊延伸PCR可以將兩段DNA序列進行融合，通過這種方法可以構建融合基因，也可以用來將無法一次獲得全長的DNA序列，通過分段擴增，再拼接的方法獲得。此外，如果「重疊」序列也可以經過特殊設計，來引入一段插入序列，如酶切位點等。
由於引物與模版不完全互補配對並不影響延伸，所以用PCR引入突變主要是在引物上「做手腳」。（但注意，引物3『末端的鹼基必須互補配對！）
在引物上添加一段序列即可獲得插入突變。這時候需要注意，對於表達序列，插入鹼基的數目一定要是三的倍數，否則會造成閱讀框移碼。在引物上替換幾個鹼基也可以引入突變，一般用於表達產物的氨基酸突變。此外，還需要提防改造後的引物匹配到模版中的其它位置。這里可以提前用blast預測看看。
限制性酶切和連接是最常見的載體構建方法。利用限制性內切酶對DNA序列和載體質粒進行酶切，暴露出相同的黏性末端或者平末端，再利用DNA連接酶（一般是T4 ligase）進行連接。
由於限制耐逗性酶切和連接的方法依賴限制性內切酶的使用，構建成功與否取決於目的DNA和載體序列上是否存在合適的酶切位點以及對應的酶。因此開發出無縫克隆的技術，不依賴限制性內切酶，使得克隆更昌虛賣加便捷，應用范圍更廣。
Gateway Cloning，翻譯成門途徑克隆，是由invitrogen公司研發的技術，目前經過多輪收購，屬於Thermo公司。Gateway的核心是利用λ噬菌體位點同源重組。
目的基因和載體基因ccdB的序列兩段帶有 att X 序列，這個 att X 可以看作是同源重組的「信號序列」，分為 "att B"、"att P"、"att L"、"att R" 四種。其中 "att B" 和 "att P" 通過BP重組酶進行交換（BP反應）；其中 "att L" 和 "att R" 通過LR重組酶進行交換（LR反應）。
目的基因首先通過與供體質粒（Donor vector）進行BP反應，獲得含有目的基因序列的克隆載體，算是「入門」。隨後可以與多種目的載體進行LR反應，將目的基因置換到目的載體當中。
ccd B 是一種致死性基因，載體上表達 ccd B 時，感受態細胞無法存活，由此來清除Gateway cloning過程中的副產物。
吉布森無縫克隆譽戚是JCVI研究所的「吉布森」教授（Daniel G. Gibson）發明，利用DNA同源重組原理，比GAteway cloning更加簡單，應用非常廣泛，基本上各大公司都有相應的產品。
首先目的DNA和載體兩段需要有15bp的同源序列。由於這段序列可以源自載體序列，通過PCR加到目的序列上，所以實際獲得的拼接是無縫的。然後通過5『外切酶是的目的序列和載體都暴露出單鏈DNA，形成類似於黏性末端的單鏈接頭，退火使目的序列和載體互補配對，利用DNA聚合酶補齊末端缺失的鹼基，再用DNA連接酶「縫合」切口，從而完成克隆。
看似用到多個酶的多步反應，通過混合酶或重組酶也可以Mix的體系，進行一步操作。
In-Fusion cloning是由clontech公司開發的，其原理與Gibson cloning大體相同，主要區別也是在於使用的酶，也屬於專利產品。
NEB公司的高保真DNA組裝與Gibson cloning的原理類似，使用的就是經過改造的重組酶，為其公司的專利產品。可以用一步反應進行DNA組裝。它的特色還在於反應中使用的酶的高保真性。
NEB公司自己就擁有上述三種克隆方法對應的產品，官網中有對它們自家的三款產品平行比較。僅供參考。
TA克隆和GC克隆是最簡單，也是最「小學生」的克隆。TA克隆利用Tag酶在PCR產物3『末端加A的特性，設計對應5『末端加T的載體與之配對。這樣PCR的產物不用經過任何處理就可以與載體進行連接，一步完成。GC克隆與之相同，是利用了另一種DNA聚合酶3』末端加G的原理，當然目前這種酶用得越來越少了，幾乎是停產，所以一般沒人使用了。
『陸』 基因克隆
基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又稱為重組DNA技術，是應用酶學方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，並使之在適當的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代DNA分子的過程。例如,要獲得人類基因組中的某個基因，我們就需要藉助基因克隆技術，進行目的基因的分離、克隆和擴增。因此，接下來，我就從基因克隆工具和具體的實驗流程兩方面進行介紹。
（ 1 ）限制性內切酶
首先介紹的是限制性核酸內切酶，它是細菌的「限制-修飾系統」防禦機制的重要一員。限制修飾系統(Restriction-Modification System, R-M system )，即限制酶和甲基化酶系統（圖1） [1]。研究者將能識別並切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖的酶稱為 限制性核酸內切酶 （Restriction endonuclease，RE，簡稱限制性內切酶或限制酶）。而宿主細菌的DNA通過甲基化酶的甲基化後，DNA的酶切位點被保護起來，不會被限制酶切割。
根據限制性內切酶的結構，識別位點，切割位點等特性可以將RE分成四類（表1）[2]，基因克隆中常用的是II型限制性內切酶。不過像IV型內切酶這種可以識別修飾化DNA，可以用於表觀遺傳學的研究。
II型限制性內切酶是目前發現的最多的一類內切酶，根據其識別位點與切割位點的特性又可以分成不同的亞型[3]，例如我們常見的識別迴文序列的內切酶， Eco R I，屬於Type IIP類型，這種酶的切割位點在畝陪識別位點內部；而像現在在CRISPR/Cas9相關基因克隆中用到的 Bpi I等酶，則屬於Type IIS型，它的切割位點離識別位點有幾個到幾十個鹼基的距離。
既然是迅沒蠢限制性內切酶，那麼酶切DNA後就會留下不同的末端類型，這其中就包括粘性末端和平末端（圖3）。所謂的粘性末端，就是酶切後有5』端或者3』端有突出鹼基的末端類型，因此又分為5』 Overhang end，例如 Hin d III，和3』 Overhang end， 例如 Pst I兩種。那些酶切後沒有突出鹼基的就屬於平末端類型， 例如 Eco R V。
DNA鹼基之間靠5』, 3』 磷酸二酯鍵連接，限制性內切酶切割DNA後，出現的是5』-P 和3』-OH（圖4）。
另外，根據限制性內切酶的功能，其又有同裂酶、異裂酶、同尾酶、可變酶和修飾敏感內切酶等類型（圖5）。其中，同裂酶(isoschizomer)，又稱異源同工酶，即從不同原核生物中分離出來的不同的Ⅱ型酶，有相同的識別特點和切割位點，例如 Age I和 Bsh T I。異裂酶則是指可以識別相同的核苷酸序列，但會在不同的位點切割 DNA，例如 Sma I和 Xma I。同尾酶(isocaudarmer)指不同來源的酶其識別和切割序列有一定的相關性，作用後能產生相同的粘性末端，例如 Age I和 Xma I，這一類的酶酶切後的產物可以進行連接，在基因克隆中有著重要的用途。可變酶則指所識別DNA序列中的一個或幾個鹼基是可變的，並且識別序列往往超過6個察消鹼基對，例如 Bst E II識別序列為：GGTNACC，其中N為一可變鹼基，可以是A/T/C/G四種中的任何一個；而 Bst N I 的識別序列為CCWGG，其中的W則表示A或者T。修飾敏感內切酶是對DNA修飾（例如甲基化修飾）敏感的限制性內切酶，例如 Bcl I對甲基化的識別位點不能切割，但無甲基化的則可以進行切割； Dpn I則剛好相反，有甲基化才能切割。
限制性內切酶有那麼多種，到底選擇那種進行呢？
首先，我們需要進行酶切位點分析，可以使用在線（ Sequence Manipulation Suite 和 analyze-sequence, Addgene ）或者本地版（SnapGene）的分析工具進行序列分析。然後結合同裂酶、異裂酶、同尾酶、可變酶特性進行RE選擇，並且同時要考慮所選限制性內切酶對修飾敏感性。另外，根據試劑使用中使用的酶的數量，我們將酶切反應可以分為單酶切、雙酶切和分步酶切。 單酶切 ：同一個體系進行一種酶切反應； 雙酶切 ：同一個體系進行兩種酶的酶切反應（針對反應條件一致的限制性內切酶）； 分步酶切 ：樣品進行完第一個酶切反應後進行純化，再進行第二個酶切反應（針對反應條件不一樣的限制性內切酶）。明確了以上信息後，我們就可以進行酶切反應了。一個酶切反應涉及樣品類型，緩沖液，酶量以及反應溫度和反應時間等。這些都可以參考限制性內切酶的產品使用說明進行操作。
（ 2 ） DNA 連接酶
限制性內切酶負責將DNA切開，DNA連接酶則是用來重新連接DNA的工具。DNA連接酶是一類催化雙鏈DNA中相鄰鹼基的5』磷酸和3』羥基間磷酸二酯鍵形成的酶（圖6）。因為是雙鏈，所以一般要求連接位點不能出現鹼基錯配。不過實際應用中，DNA連接酶也會將有少量錯配的DNA進行連接。DNA連接酶主要有兩種：T4 DNA連接酶（平末端和粘性末端均可連接），大腸桿菌DNA連接酶（只能連接粘性末端）。
（ 3 ） DNA 聚合酶
之前我們介紹過PCR聚合酶鏈式反應，其中使用的就是DNA聚合酶。實際上，DNA聚合酶長具備三種酶活性（圖7）：用於新鏈DNA合成的DNA聚合酶活性，用於錯誤參入鹼基校正的3』-5』核酸外切酶活性，還有5』-3』 核酸外切酶活性，在DNA復制中用於去除RNA 引物。藉助這一活性，可以進行Nick translation，用於標記核苷酸參入等。但並不是每一種DNA聚合酶都這三種酶活性，NEB官網提供了一系列DNA聚合酶及其具備的功能活性（ DNA Polymerase Selection Chart-NEB ）。
根據所使用的DNA聚合酶類型不同，PCR產物的末端有3』-A粘性末端和平末端兩種類型。其中Taq DNA polymerase因為缺乏3』-5』 exonuclease活性，其PCR的保真度低，且PCR產物的3』端多一個粘性末端A；而 高保真DNA polymerase保留3』-5』 exonuclease活性，有很高的校正活性，其PCR產物為平末端。
（ 4 ）無縫克隆技術
除了上面介紹的用於傳統基因克隆中國的相關工具外，研究者開發了新型的基於插入片段和線性化載體的末端進行同源重組的基因克隆技術，即無縫克隆技術（Seamless Cloning），主要包括Gibson Assembly[4]和Getway Clone兩種。這里我們重點介紹其中的Gibson Assembly。
Gibson Assembly技術包含了DNA 5' 外切酶(5' Exonuclease)、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA連接酶(DNA Ligase)活性的重組酶(assembly enzyme)，通過同源重組的方法可以將一個或多個DNA片段按照預定方向、快速、高效和精確地插入到線性化載體中，並且最終構建的克隆沒有任何額外的鹼基序列，因此被稱作「無縫克隆」。如圖9中Gibson Assembly所示，紅色和綠色2個片段為需要連接的雙鏈DNA片段，它們末端有相同的15-25個重疊序列（黑色），首先在50℃條件下，T5 exonuclease核酸外切酶降解5』端的一些鹼基，形成3』端突出的單鏈，3』端單鏈互補退火；然後Phusion高保真聚合酶補上兩條單鏈之間的缺口；最後Taq DNA ligase將相鄰的單鏈切口連接補齊形成完整的DNA雙鏈（圖6）。
在Gibson Assembly基礎上，研究者開發了TEDA[5]，僅添加T5 exonuclease核酸外切酶同樣可以實現重組克隆，它與藉助細胞體內的DNA修復機制進行缺損DNA的修復（圖6）。
（ 5 ）工具載體
接下來我們介紹基因克隆中常用的工具載體。按照功能分，載體分為克隆載體和表達載體（表2）。其中克隆載體含有能在原核細胞中復制的元件，用來克隆和擴增基因；表達載體除了具備克隆載體的基本元件外，還具有轉錄/翻譯所必須的DNA順式元件。以下，我們將以SnapGene或addgene分析的載體結構圖進行相關功能元件的說明。
以pUC19為例，說明克隆載體中的功能元件（圖10）。
復制起始位點（ Origin of replication ， ORI ）： ORI是一段DNA序列，質粒復制的起始位置。DNA解螺旋酶可以作用於這段序列，然後DNA的雙鏈被分開，復制隨即開始。質粒必須是能夠復制的，否則隨著細菌的生長，質粒的數量將會被迅速稀釋。 篩選標記，主要指抗生素抗性基因。 在含有抗生素的培養基中培養細菌，能夠生長的就是含有目的質粒，因為，不含質粒的細菌已經被「殺死」了，原核中常用的抗性篩選基因有Amp和Kan。 Lac Z ：β-半乳糖苷酶基因，也是一種篩選標記，用於藍白斑篩選。 多克隆位點（ multiple cloning site, MCS ）， 這是一段短DNA片段，包括多個限制性酶切的單一位點，便於外源基因的插入。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。
以pcDNA3.1為例，說明表達載體中的功能元件（圖11）。
表達載體pcDNA3.1除了有克隆載體相關元件，如復制起始位點Ori，原核篩選標記Amp外，還有一些其他的功能元件，如表3所示。
表達載體主要用於表達蛋白或者RNA，例如現在基因編輯中常用的一個表達載體PX458（圖12），可以同時表達Cas9蛋白和sgRNA。因此上面也會攜帶一些其他的功能元件（表4）。
上面介紹的pcDNA3.1和PX458均是瞬時表達載體並不能在人類等細胞中進行復制，隨著細胞的分裂，單個細胞中的質粒不斷的被稀釋，因此這些載體只能起到瞬時表達的效果。而慢病毒表達載體則可以介導表達元件整合到人類細胞的基因組中，這些表達元件可以隨著基因組DNA的復制而復制，因此可以實現穩定表達。
我們常用的慢病毒載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體，攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，將其進行收集和濃縮後可直接感染宿主細胞或者動物模型，將外源基因有效地整合到宿主的染色體上，從而達到外源基因的持久性表達。我們以pGreenPuro為例說明慢病毒表達載體中一些關鍵的功能元件（圖13，表5）。
（6）感受態細胞
感受態細胞是採用理化方法誘導過的細胞，它可以吸收周圍環境中的DNA分子。實驗室中我們常使用 E. coli 進行感受態細胞的制備，主要包括克隆用的感受態細胞和表達用的感受態細胞（圖14）。
如果僅僅是進行質粒擴增，我們一般使用克隆感受態細胞。如果要進行原核蛋白質表達，我們則選擇表達感受態細胞。並且感受態細胞的基因型也有很多類，是通過不同基因的缺失形成的，因而使細胞具有不同的特性，以滿足不同的需要。例如，進行克隆載體和瞬轉表達載體的擴增，常選用 E. coli DH5α，TOP10菌株；而慢病毒載體則一般選擇低重組率的 E. coli Stbl3菌株。而對於非甲基化載體的擴增，則需要選擇 E. c oli dam-/dcm- 等甲基化酶缺失的菌株。
2. 基因克隆流程
前面了解了基因克隆使用的相關工具酶和載體，接下來，我們介紹基因克隆的實驗流程。細分的話，包括以下10個步驟（表6）。
下面我們以lncRNA PVT1的克隆和表達，分別採用T/A克隆，傳統酶切-酶連克隆和無縫克隆進行示例。
(1) T/A克隆
T/A克隆是把PCR片段與一個具有3』-T突出的載體DNA連接起來的方法（圖15）。使用該方法進行基因克隆時不需要考慮酶切位點問題，但需要選擇Taq DNA聚合酶進行PCR擴增，其產物的3』端才會多一個突出的A；此外，T/A克隆選用商業化的T載體，其為線性化的載體，在3』端有一個突出的T；並且基因片段連入T載體是沒有方向性的，正反都有可能。
我們首先從NCBI上獲取PVT1（human）的基因序列信息（ https ://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MG562504.1 ），然後使用SnapGene等進行PCR引物設計（圖16）。以PVT1全長序列（1081nt）為模板，設計的引物正向引物的5』端與PVT1序列的5』端相同，反向引物的5』端與PVT1序列的3』端互補。然後使用Taq DNA 聚合酶，以細胞的cDNA為模板進行PCR，產物經瓊脂糖凝膠電泳或割膠回收目的大小片段（圖17）。
膠回收的基因片段與商業化的T載體（pMD-18T）連接，形成重組DNA載體pMD18-PVT1（圖18），經轉化（圖19）和菌落PCR（圖20）後篩選到候選陽性克隆，再使用Sanger測序（圖21）進行插入序列的鑒定，獲得陽性克隆。
（2） 傳統酶切 - 酶連克隆
傳統酶切-酶連克隆主要是採用相同的限制性內切酶（或者同尾酶）分別酶切載體和基因片段，然後使用DNA連接酶進行連接，轉化。以下，我們同樣以PVT1為例，將其使用傳統方法克隆至pcDNA3.1表達載體上。
我們在獲得PVT1的基因全長序列後，需要首先進行酶切位點分析，例如使用SnapGene進行常用6鹼基識別位點的限制性內切酶位點分析（圖22）。同時，我們分析pcDNA3.1中MCS中可用的酶切位點，我們排除PVT1有的限制性內切酶並排除同尾酶（避免載體的自連），即可得到可用的限制性內切酶。在這里我們選擇 Nhe I和 Eco R I（圖23）。
接下來，我們以PVT1的全長序列為模板設計克隆引物（SnapGene設計的引物序列與T/A克隆中一樣），不過我們還要在引物的5』端添加選擇好的限制性內切酶的酶切位點以及相應的保護鹼基（圖24）。同樣使用Taq DNA 聚合酶或者其他高保真DNA聚合酶，以細胞的cDNA為模板進行PCR，產物經瓊脂糖凝膠電泳或割膠回收目的大小片段。
回收的PVT1 PCR產物和pcDNA3.1載體均使用 Nhe I和 Eco R I進行雙酶切，其中PVT1由於酶切後的序列為一個約1000bp的片段和一個約5bp的片段，無需進行割膠回收，直接使用PCR產物純化柱進行酶切產物純化即可（圖25）。而pcDNA3.1的酶切由於可能存在未完全切開的質粒（在後續轉化中會形成大量的假陽性克隆），需要進行瓊脂糖凝膠電泳，割取線性化的載體片段進行膠回收（圖25）。然後將PVT1和pcDNA3.1酶切片段使用DNA連接酶進行連接，轉化。同樣，使用菌落PCR和Sanger測序進行陽性克隆子pcDNA3.1-PVT1的篩選（圖26）。
（3） 無縫克隆
無縫克隆的一個重要優勢是不需要考慮待克隆片段中的酶切位點情況，因此直接選擇相應的酶切位點將載體線性化後，根據載體的線性化末端進行同源引物的設計，PCR擴增目的基因並純化後直接進行重組連接和轉化（圖27）。以下，我們同樣以PVT1克隆至pcDNA3.1載體為例進行說明。
獲得PVT1和pcDNA3.1的全長序列後可以使用SnapGene，CE Design（Vazyme）和In-Fusion Clone（Takara）等在線或本地軟體進行同源臂引物的設計。
使用同源臂引物，以細胞cDNA為模板，使用高保真DNA聚合酶為模板進行PCR，膠回收相應片段。pcDNA3.1載體使用 Nhe I和 EcoR I進行雙酶切後，割膠回收載體片段。然後添加無縫克隆試劑進行重組連接，轉化後進行陽性克隆的篩選與鑒定。
而實際上，無縫克隆還有另外一個重要的優勢：可以同時進行多片段的重組克隆，而這對於傳統酶切-酶連克隆是一個很大的挑戰。基於傳統克隆技術可能需要克隆一個片段後，再在特定位置選擇酶切位點，插入第二個片段，依次推進，這樣不僅實驗周期長，並且會在每個片段之間引入了額外的酶切位點鹼基序列，可能影響到基因的完整性。不過可以通過融合PCR的方式，設計末端重疊的引物進行各個克隆片段的融合，但長的基因片段的PCR擴增本身也存在著失敗率提高的問題（表8）。
總結
本部分我們主要介紹了基因克隆中使用的工具酶和載體，並以PVT1的克隆和表達載體的構建為例，分別介紹了T/A克隆、傳統酶切-酶連克隆和無縫克隆技術的實驗流程。
參考文獻
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『柒』 什麼叫DNA克隆技術
克隆」是從英文「clone」音譯而來，在生物學領域有3個不同層次的含義。
1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含義是將某一特定DNA片斷通過重組DNA技術插入到一個載體(如質粒和病毒等)中，然後在宿主細胞中進行自我復制所得到的大量完全相同的該DNA片斷的「群體」。
2．在細胞水平，克隆實質由一個單一的共同祖先細胞分裂所形成的一個細胞群體。其中每個細胞的基因都相同。比如，使一個細胞在體外的培養液中分裂若干代所形成的一個遺傳背景完全相同的細胞集體即為一個細胞克隆。又如，在脊椎動物體內，當有外源物(如細菌或病毒)侵入時，會通過免疫反應產生特異的識別抗體。產生某一特定抗體的所有漿細胞都是由一個B細胞分裂而成，這樣的一個漿細胞群體也是一個細胞克隆。細肢喊空胞克隆是一種低級的生殖方式－無性繁殖，即不經過兩性結合，子代和親代具有相同的遺傳性。生物進化的層次越低，越有可能採取這種繁殖方式。
3．在個體水平，克隆是指基因型完全相同的兩個或更多的個體組成的一個群體。比如，兩個同卵雙胞胎即為一個克隆！因為他（她）們來自同一個卵細胞，所以遺傳背景完全一樣。按此定義，「多利」並不能說成是一個克隆！因為「多利」只是孤單的一個。只有當那些英國胚胎學家能將兩個以上完全相同的細胞核移植到兩個以上完全相同的去核卵細胞中，得到兩個以上遺傳背景完全相同的「多利」時才能用克隆這個詞來描述。所以在那篇發表於1997年2月出版在《Nature》雜志上的轟動性論文中，作者並沒有把「多利」說成是一個克隆。
另外，克隆也可以做動詞用，意思是指獲得以上所言DNA、細胞或個體群體的過程。
二、克隆技術
1．DNA克隆
現在進行DNA克隆的方法多種多樣，其基本過程如下圖所示(未按比例)
可見，這樣得到的DNA可以應用於生物學研究的很多方面，包括對特異DNA的鹼基順序的分析和處理，以及生物技術工業中有價值蛋白質的大量生產等等。
2．生物個體的克隆
(1)植物個體的克隆
在20世紀50年代，植物學家用胡蘿卜為模型材料，研究了分化的植物細胞中遺傳物質是否丟失問題，他們驚奇地發現，從一個單一已經高度分化的胡蘿卜細胞
可以發育形成一棵完整的植株!由此，他們認為植物細胞具有全能性。從一棵胡蘿卜中的兩個以上的體細胞發育而成的胡蘿卜群體的遺傳背景完全一樣，故為一個克隆。如此的植物的克隆過程是一個完全的無性繁殖過程!
(2)動物個體的克隆
① 「多利」的誕生
1997年2月27日英國愛丁堡羅斯林(Roslin)研究所的伊恩·維爾莫特科學研究小組向世界宣布，世界上第一頭克隆綿羊「多利」(Dolly)誕生，這一消息立刻轟動了全世界。
「多莉」的產生與三隻母羊有關。一隻是懷孕三個月的芬蘭多塞特母綿羊，兩只是蘇格蘭黑面母綿羊。芬蘭多塞特母綿羊提供了全套遺傳信息，即提供了細胞核（稱之為供體）；一隻蘇格蘭黑面母綿羊提供無細胞核的卵細胞；另一隻蘇格蘭黑面母綿羊提供羊胚胎的發育環境——子宮，是「多莉」羊的「生」母。其整個克隆過程簡述如下：
從芬蘭多塞特母綿羊的乳腺中取出乳腺細胞，將其放入低濃度的營養培養液中，細胞逐漸停止了分裂，此細胞稱之為供體細胞；給一頭蘇格蘭黑面母綿羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵細胞，並立即將其細胞核除去，留下一個無核的卵細胞，此細胞稱之為受體細胞；利用電脈沖的方法，使供體細胞和受體細胞發生融合，最後形成了融合細胞，由於電脈沖還可以產生類似於自然受精過程中的一系列反應，使融合細胞也能象受精卵一樣進行細胞分裂、分化，從而形成胚胎細胞；將滲握胚胎細胞轉移到另一隻蘇格蘭黑面母綿羊的子宮內，胚胎細胞進一步分化和發育，最後形成一隻小綿羊。出生的「多莉」小綿羊與多塞特母綿羊具有完全相同的外貌。
一年以後，另一組科學家報道了將小鼠卵丘細胞(圍繞在卵母細胞外周的高度分化細胞)的細胞核移植到去除了細胞核的卵母細胞中得到20多隻發育完全的小鼠。如呆「多利」因為只有一隻，還不夠叫做克隆羊的話，這些小鼠
就是名副其實的克隆鼠了。
② 通過細胞核移植克隆小鼠的基本過程
在本實驗中，卵丘細胞是經如下過程得到的：通過連續幾次注射絨毛膜促性腺激素，使雌鼠誘導成高產卵量狀態。然後從雌鼠輸卵管中收集卵丘細歷瞎胞與卵母細胞的復合體。經透明質酸處理使卵丘細胞散開。選擇直徑為10－12微米的卵丘細胞用作細胞核供體（前期實驗表明，若用直徑更小或更大的卵丘細胞的細胞核，經過細胞核移植的卵母細胞很少發育到8細胞期）。所選擇的卵丘細胞保持在一定的溶液環境中，在3小時內進行細胞核移植（與此不同的是，在獲得「多利」時用作細胞核供體的乳腺細胞先在培養液中傳代了3－6次）
卵母細胞（一般處於減數分裂中期 II ）通過與上面描述類似的方法，從不同種的雌鼠中收集。在顯微鏡下小心地用直徑大約7微米的細管取出卵母細胞的細胞核，盡量不取出細胞質。同樣小心取出卵丘細胞的細胞核，也盡量去除所帶的細胞質（通過使取出的細胞核在玻璃管中往復運動數次，以去除所帶的少量的細胞質）。在細胞核被取出後5分鍾之內，直接注射到已經去除了細胞核的卵母細胞中。進行了細胞核移植的卵母細胞先放在一種特製的溶液中1－6小時，然後加入二價的鍶離子（Sr2+）和細胞分裂抑素B。前者使卵母細胞激活，後者抑制極體的形成和染色體的排除。再取出處理過的卵母細胞，放在沒有鍶和細胞分裂抑素B的特製的溶液中使細胞分裂形成胚胎。
不同階段的胚胎（從2細胞期到胚泡期）被分別植入幾天前與已經結扎雄鼠交配過的假孕母鼠的輸卵管或子宮中發育。發育完全的胎兒鼠在大約19天後通過手術取出。
目前胚胎細胞核移植克隆的動物有小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛和猴子等。在中國，除猴子以外，其他克隆動物都有，也能連續核移植克隆山羊，該技術比胚胎分割技術更進一步，將克隆出更多的動物。因胚胎分割次數越多，每份細胞越少，發育成的個體的能力越差。體細胞核移植克隆的動物只有一個，就是「多利」羊。
三、克隆技術的福音
1． 克隆技術與遺傳育種
在農業方面，人們利用「克隆」技術培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病蟲害的優質高產品種，大大提高了糧食產量。在這方面我國已邁入世界最先進的前列。
2． 克隆技術與瀕危生物保護
克隆技術對保護物種特別是珍稀、瀕危物種來講是一個福音，具有很大的應用前景。從生物學的角度看，這也是克隆技術最有價值的地方之一。
3． 克隆技術與醫學
在當代，醫生幾乎能在所有人類器官和組織上施行移植手術。但就科學技術而言，器官移植中的排斥反應仍是最為頭痛的事。排斥反應的原因是組織不配型導致相容性差。如果把「克隆人」的器官提供給「原版人」，作器官移植之用，則絕對沒有排斥反應之慮，因為二者基因相配，組織也相配。問題是，利用「克隆人」作為器官供體合不合乎人道？是否合法？經濟是否合算？
克隆技術還可用來大量繁殖有價值的基因，例如，在醫學方面，人們正是通過「克隆」技術生產出治療糖尿病的胰島素、使侏儒症患者重新長高的生長激素和能抗多種病毒感染的干撓素，等等。