『壹』 無縫克隆的引物怎麼設計能詳細的介紹嗎
題目太大了，要有針對性的問題回答才有意義嘛 你的意思是目的基因已經放在一個質粒上，專然後你想亞克屬隆到另外一個載體上？ 如果是這樣的話 1 你先看你想連接的載體上面有哪些克隆位點（酶切位點可以用），然後看你原來的質粒上基因兩端有沒有這些。
『貳』 基於無縫克隆技術構建基因敲除載體
ClonExpress技術是一種簡單、快速並且高效的 DNA 無縫克隆技術，可將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點。 ClonExpress®II 是新一代重組克隆試劑盒，包含增強的重組酶 Exnase®II。使用任意方式將載體進行線性化；在插入片段正 / 反向 PCR 引物 5』 端引入線性化載體的末端序列，使得 PCR 產物 5』 和 3』 最末端分別帶有和線性化載體兩末端一致的序列 (15 bp-20 bp)。這種兩端帶有載體末端序列的 PCR 產物和線性化載體按一定比例混合後，在Exnase®II 重組酶的催化下，僅需反應 30 min 即可進行轉化，完成定向克隆，陽性率可達 95% 以上。
⑴ 線性化載體的制備
通過限制性核酸內切酶酶切載體使其線性化。
⑵ 插入片段的獲得：
將線性化載體末端15 - 20 bp序列作為同源序列(藍色和紅色標記)，並將其分別添加到基因特異性正/反向擴增引物序列的5』端，以此對引物擴增得到帶有同源序列的插入片段。
⑶ 重組反應：
將線性化載體和插入片段按比例混合，在重組酶Exnase 催化下，37℃反應30min即可完成重組反應，實現兩線性化DNA的體外環化。
⑷ 轉化感受態細胞：
重組產物直接進行轉化，平板上會形成數百個單克隆供後期陽性篩選。
Reference:
C112 CloneExpress Ⅱ One Step Cloning Kit
『叄』 在做克隆時，載體與目的片段的比例怎樣確定
克隆載體是能夠通過限制性內切酶,將目的dna片段整合進去,並且能夠轉入宿主細胞進行表達的生物dna.
通常採用從病毒、質粒或高等生物細胞中獲取的dna作為克隆載體,在載體上插入合適大小的外源dna片段,並注意不能破壞載體的自我復制性質.將重組後的載體引入到宿主細胞中,並在宿主細胞中大量繁殖.常見的載體有質粒,噬菌粒,酵母人工染色體.
對載體的要求：①能在宿主細胞中復制繁殖,而且最好要有較高的自主復制能力.②容易進入宿主細胞,而且進入效率越高越好.③容易插入外來核酸片段,插入後不影響其進入宿主細胞和在細胞中的復制.這就要求載體dna上要有合適的限制性核酸內切酶位點.④容易從宿主細胞中分離純化出來,
這才便於重組操作.⑤有容易被識別篩選的標志,當其進入宿主細胞、或攜帶著外來的核酸序列進入宿主細胞都能容易被辨認和分離出來.
『肆』 如何設計無縫克隆法能將同時兩個dna片段插入載體的引物
目的mRNA在細胞中的含量占細胞質總mRNA量的0.5%以下.
5,mRNA的富集方法
典型的哺乳動物細回胞含有10,000-30,000種不同的答mRNA分子,某些mRNA分子在細胞內的拷貝數很低甚至只有一個拷貝.
mRNA的豐度與文庫克隆子數的關系
ln(1-P)
N= ln(1-1/n)
N: 所需克隆數; P: 要求的概率; n:一種mRNA在總mRNA中的相對比例
1) 按大小對mRNA進行分級分離
* 通過瓊脂糖凝膠電泳分離大小不同的mRNA分子,該方法的分離效果最好,但從凝膠中回收的得率較低.
* 蔗糖梯度離心:加入破壞RNA二級結構的變性劑如氫氧化甲基汞等,再進行蔗糖梯度離心以分離不同分子量的mRNA.
『伍』 ta克隆中基因與載體比例有何講究
基因與載體比例一般為3:1或4：1。基因要相對多，載體要相對少。避免載體自連。
『陸』 pcr產物直接做無縫克隆如何設計引物
PCR引物設計原則
1、引物長度一般在15-30bp。
引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不應大於38bp，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA聚合酶進行反應；
2、引物GC含量一般為40%-60%。
引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，GC含量過高或過低都不利於引發反應。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右。
Tm值在72℃左右可使復性條件最佳，至少要在55-80℃之間。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟體中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)；
4、引物3』端的鹼基一般不用A。
引物3』端的鹼基一般不用A，因為A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高。
5、引物3』端出現3個以上的連續鹼基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加。
6、引物3』端的互補、二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。
7、如擴增編碼區域，引物3』端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第三位易發生簡並，會影響擴增特異性與效率；
8、引物5』端可以修飾。
引物5』端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。
9、鹼基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續4個鹼基的互補。