『壹』 无缝克隆的引物怎么设计能详细的介绍吗
题目太大了，要有针对性的问题回答才有意义嘛 你的意思是目的基因已经放在一个质粒上，专然后你想亚克属隆到另外一个载体上？ 如果是这样的话 1 你先看你想连接的载体上面有哪些克隆位点（酶切位点可以用），然后看你原来的质粒上基因两端有没有这些。
『贰』 基于无缝克隆技术构建基因敲除载体
ClonExpress技术是一种简单、快速并且高效的 DNA 无缝克隆技术，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。 ClonExpress®II 是新一代重组克隆试剂盒，包含增强的重组酶 Exnase®II。使用任意方式将载体进行线性化；在插入片段正 / 反向 PCR 引物 5’ 端引入线性化载体的末端序列，使得 PCR 产物 5’ 和 3’ 最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列 (15 bp-20 bp)。这种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化载体按一定比例混合后，在Exnase®II 重组酶的催化下，仅需反应 30 min 即可进行转化，完成定向克隆，阳性率可达 95% 以上。
⑴ 线性化载体的制备
通过限制性核酸内切酶酶切载体使其线性化。
⑵ 插入片段的获得：
将线性化载体末端15 - 20 bp序列作为同源序列(蓝色和红色标记)，并将其分别添加到基因特异性正/反向扩增引物序列的5’端，以此对引物扩增得到带有同源序列的插入片段。
⑶ 重组反应：
将线性化载体和插入片段按比例混合，在重组酶Exnase 催化下，37℃反应30min即可完成重组反应，实现两线性化DNA的体外环化。
⑷ 转化感受态细胞：
重组产物直接进行转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选。
Reference:
C112 CloneExpress Ⅱ One Step Cloning Kit
『叁』 在做克隆时，载体与目的片段的比例怎样确定
克隆载体是能够通过限制性内切酶,将目的dna片段整合进去,并且能够转入宿主细胞进行表达的生物dna.
通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的dna作为克隆载体,在载体上插入合适大小的外源dna片段,并注意不能破坏载体的自我复制性质.将重组后的载体引入到宿主细胞中,并在宿主细胞中大量繁殖.常见的载体有质粒,噬菌粒,酵母人工染色体.
对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖,而且最好要有较高的自主复制能力.②容易进入宿主细胞,而且进入效率越高越好.③容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制.这就要求载体dna上要有合适的限制性核酸内切酶位点.④容易从宿主细胞中分离纯化出来,
这才便于重组操作.⑤有容易被识别筛选的标志,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来.
『肆』 如何设计无缝克隆法能将同时两个dna片段插入载体的引物
目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下.
5,mRNA的富集方法
典型的哺乳动物细回胞含有10,000-30,000种不同的答mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝.
mRNA的丰度与文库克隆子数的关系
ln(1-P)
N= ln(1-1/n)
N: 所需克隆数; P: 要求的概率; n:一种mRNA在总mRNA中的相对比例
1) 按大小对mRNA进行分级分离
* 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好,但从凝胶中回收的得率较低.
* 蔗糖梯度离心:加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等,再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.
『伍』 ta克隆中基因与载体比例有何讲究
基因与载体比例一般为3:1或4：1。基因要相对多，载体要相对少。避免载体自连。
『陆』 pcr产物直接做无缝克隆如何设计引物
PCR引物设计原则
1、引物长度一般在15-30bp。
引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；
2、引物GC含量一般为40%-60%。
引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。
Tm值在72℃左右可使复性条件最佳，至少要在55-80℃之间。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)；
4、引物3’端的碱基一般不用A。
引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。
5、引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
6、引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
7、如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第三位易发生简并，会影响扩增特异性与效率；
8、引物5’端可以修饰。
引物5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
9、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。