『壹』 无缝克隆引物不含酶切位点设计原理
无缝克隆，让载体构建变得像搭积木一样简单
吴思涵
知芹余扰识星球「生物狗窝」，生物医学同行交流社区
前言
提起“克隆”、“载体构建”这两个词，似乎总会同时提到“限制性内切酶”。没错，在过去数十年，用限制性内切酶产生黏性末端，并通过碱基互补配对，连接两个甚至更多片段的克隆方法，是载体构建的经典方案。
近年嫌旦来，“无缝克隆”逐渐受到科学家的欢迎。相比之下，无缝克隆操作更加简单，灵活性更强，同时几乎不受序列的限制，一次可定向组装高达10个片段的dsDNA。这篇文章将带大家认识无缝克隆的原理、优势和应用。
一、无缝克隆的原理
首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：Gibson assembly和Golden Gate assembly。由于Golden Gate assembly依赖于Type IIS限制性DNA内切酶（如BsaI，BbsI等），一旦载体不携带相应的识别序列，这种方法就走不通了。而假设通过PCR引入Type IIS内切酶识别序列，那便不是真毁宴正意义上的“无缝”了。因此本文所提的“无缝克隆”，特指Gibson assembly流，不涉及任何Golden Gate及其他流派。
目前，无缝克隆比较著名的商品化名字有NEB家的Gibson Assembly和NEBuilder HiFi DNA Assembly，Clontech家的In-Fusion，以及Invitrogen家的GeneArt等。但无论叫什么名字，其基本原理都和早期的Gibson assembly的是一样的。
与传统的双酶切克隆一般，无缝克隆同样需要依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对，并利用DNA连接酶催化形成磷酸二酯键修复缺口（nick）。但是，无缝克隆并不使用“内切酶”来制造黏性末端，而是通过“外切酶”来产生的。
（Tips 1：“内切酶”是在核酸链内部进行“一刀两断”剪切的酶，而“外切酶”是在核酸链的末端、即外部进行“逐个碱基”剪切的酶）
在无缝克隆中使用的外切酶是T5核酸外切酶，它能沿着5’→3’方向，降解dsDNA，从而产生黏性末端。
（Tips 2：T5外切酶同时具有ssDNA外切酶活性，但并不降解超螺旋dsDNA。）
读到这里大家应该能想到，假设要拼接的两个片段的末端，是一模一样的碱基序列，那么通过T5外切酶，就能产生几乎一致的黏性末端了。没错，无缝克隆的原理便是如此。如下图所示，假如我们需要将3个片段按照1→2→3的顺序拼接起来，只需要保证1的末尾和2的开头，以及2的末尾和3的开头，具有同样的序列即可（我们可称之为同源臂）。这个同源臂序列，并不是额外添加进去的，而是载体或者拼接片段本身携带的。也就是说，我们可以通过PCR的方法，在外源拼接片段的两端加上线性化载体
『贰』 掌握这些技术，基因克隆不是梦
在过去的几十年里,分子生物学家已经开发许多可以用来更快地构建目的DNA序列结构的技术来简化和规范克隆过程。
你熟悉这些克隆技术吗?下面我们来看看这些技术的特点。
1, 限制性酶切与连接法
长期以来，限制酶切与连接法被认为是一种传统的克隆方法。这个方法便宜灵活，可以分为两步过程：酶切和连接。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA片段上并切割双链DNA。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中，最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。这个方法原理较简单，我不做过多介绍。
2, Gateway 克隆技术
Gateway克隆发明于九十年代末，由walhout[2]等提出，一种通用性的克隆方法，与传统克隆方法相比，Gateway技术的优点是可以不必考虑目的DNA 是否有合适的酶切位点，也不必进行繁琐而费时费力的酶切和连接反应，就可以按确定的方向和读码框快速而准确地将目的基因克隆到各种与Gateway技术兼容的目的载体上。
它利用λ噬菌体与大肠杆菌染色体之间发生的位点特异性的重组整合与切除反应，即LR和BP。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR 反应是一个attR入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或多个目的载体。重组位点attB、attP、attL和attR 由噬菌体λ和大肠杆菌编码的酶合剂特异识别。
Invitrogen公司开发了包括运用于原核、酵母、昆虫和哺乳动物等不同宿主的表达载体，大大提高了Gateway技术的适用性。Gateway技术已被广泛用于高通量载体的构建
3, Gibson Assembly
传统的限制性内切酶克隆技术，会在两个片段的结合位置上形成一道“疤”或“缝”，这种瑕疵可能会对DNA片段的行为产生微妙的影响。这一点特别令合成生物学家头疼，因为他们常常要将启动子和终止子这样的DNA片段转变为可预测的独立元件。Now我给大家介绍一下Gibson Assembly，一种无缝克隆方法。
Gibson组装最早由Daniel Gibson博士和他的同事J. Craig Venter在2009年提出[3]。Gibson组装非常适合用于拼接多个线性DNA片段，当然也适合将目的DNA插入载体中。如下图所示，首先，需要在DNA片段的末端加上同源片段（通过PCR法加上）；然后，将这些DNA片段和一种master mix（含有三种酶）混合孵育一个小时就可以了。这种master mix含有三种不同类型的酶：1）一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合。2）一种聚合酶，用于修补gap。3）一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子。
这个系统最厉害的是，这三种酶都可以在同一个温度下很好的发挥功能，所以整个反应在50摄氏度条件下一个小时就可以完成。一小时后，样品可以直接用于转化。当然Gibson Assembly也有缺陷，这一过程并没有生成限制性酶切位点，因而不方便将拼接片段转移到另一个载体上。建议最好是事先设计好限制性位点。需要注意的是，如果一次性组装超过5个片段，成功率会大大降低。
4, Golden Gate 拼装法
Golden Gate 拼装法主要是依赖于一种II型限制性内切酶(ⅡS 型酶，如 BsaⅠ和 AarⅠ)，这种酶能够在其DNA 识别处的相邻位置进行剪切[4]。如果人为设计识别位点不同的相邻序列，就可利用同种限制酶产生不同的粘性末端，从而一次组装多个片段，这克服了传统多片段组装时限制酶种类的限制。
具体到原理：一般的内切酶分为三种，通常用的是2类的酶，识别特定的回文序列，并从中切开。而golden gate一般用的是3类酶，一般以bsmb 1，Bsa1, Bbs1这三种酶，识别特定的序列，并在特定序列以后隔几个任意的碱基切开，这样子就可以克服2类酶必须要回文序列才能用的缺点，实现片段的连接。
另外，要说的是连接部分，传统的连接酶是T4用的比较多，T4可以连接黏性末端跟平末端，而golden gate里用的是T7，它的特点是只能实现连接黏性末端。因为T7的这一特性，所以在连接的时候可以把片段跟切好的载体混到一种特殊的buffer里，在这里内切酶跟T7都可以保持比较高的活性，通过温度的调节，实现克隆的构建。因为用的是T7，所以不用担心PCR片段自连降低克隆效率，又因为是用的三类酶，可以通过黏性末端的设计，可以一种酶切多个片段，又不用担心这几个片段之间的乱连，来达到分子克隆的目的[5]。
5, TOPO克隆(TA克隆)
TOPO克隆使用DNA拓扑异构酶I，该酶同时具有限制酶和连接酶的特性。这种酶在复制期间切割并重新连接DNA，整个克隆过程可以在室温下完成，且仅需5分钟。TOPO克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
Topo TA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA 拓扑异构酶I。
pCR-TOPO 载体也是一种 T 载体，只是在其 3’末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 Ⅰ ，当带 3′ 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口连接起来。
自沃森，克里克在1953年发现DNA双螺旋结构不过60余年，如今的DNA克隆技术却已发展到如此的程度。合成生物学正处在高速发展时期，这些进步技术的进步必将推动生物革命浪潮的到来。你都掌握了吗？
Reference
[1] 李华琴,林陈水,张文倩. 不依赖连接反应的高通量克隆方法. 氨基酸和生物资源.2013,35(4):43-46
[2] Walhout A J M, Temple G F, Brasch M A, et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes[J]. Methods in enzymology, 2000, 328: 575-IN7.
[3] Gibson, D.G., et al. (2009) Nat. Methods 6, 343-345.
[4] Morbitzer R, Elsaesser J, Hausner J, et al. Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by molar cloning[J]. Nucleic acids research, 2011, 39(13): 5790-5799.
[5] https://www.hu.com/question/49568914/answer/116646832
『叁』 DNA克隆概念
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质——同源或异源、原核或真核、天然或人工的DNA与载体DNA相结合成一具有自我复制能力的DNA分子—散态—漏厅复制子，继冲搜源而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。
『肆』 什么是基因克隆
基因克隆即重组DNA技术,指在体外对DNA分子按照既定族闭旦的目的和方案,采用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连接,组装成一个新的DNA分子.在此基础上,将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞,使它能够在宿主细胞中扩增,形成大量的子代分子,此兆扰过程即称为基因克隆.基因克隆包括四个基本技术环态镇节:
『伍』 SnapGene软件教程之分子克隆功能&技术原理
最近在做克隆载体，入手了一款非常好用的软件 SnapGene 。网上教程挺多的，其中最推崇 四方居士 的 视频教程 ，在优酷上可以直接观看。
这款软件用来绘制图谱，编辑序列，设计引物，重组克隆都非常方便。对于克隆，在软件的Action工具栏内除了常规的限制性酶切插入克隆 ，PCR等常规操作，还列出了5种成熟的商业化的 无缝克隆 供使用者选择。这5种克隆技术分别是：
<!> 本文作为观后笔记，将四方居士讲解的克隆技术的原理进行文字记录和整理，以便收藏和分享。更多内容，请大家一定去观看四方居士的视频教程！
PCR是所有分子生物学实验的基础，全称为聚合酶链式反应，通过高温变性，退火和延伸反应三部曲来扩增目的DNA序列。通过引物的设计变化，扩增反应的组合，特殊酶的使用等等，基础的PCR反应可以有千万种变化。下面介绍两种在克隆构建中经常会被用到的PCR方法。
不论变种PCR设计得多么复杂，只要画成示意图，就能一目了然。真是一图抵千言。
如图所示，重叠延伸PCR中的“重叠”指的就是两组PCR的产物，通过引物引入一段相同的序列。这段相同的序列，使得两组PCR产物的单链能够在退火时结合，这种杂交产物在DNA聚合酶的帮助下延伸成完整的DNA双链。再通过最两端的引物对融合的长篇段DNA进行扩增。
需要注意的是，引物设计时引入的“重叠”序列是反向互补配对的。
重叠延伸PCR可以将两段DNA序列进行融合，通过这种方法可以构建融合基因，也可以用来将无法一次获得全长的DNA序列，通过分段扩增，再拼接的方法获得。此外，如果“重叠”序列也可以经过特殊设计，来引入一段插入序列，如酶切位点等。
由于引物与模版不完全互补配对并不影响延伸，所以用PCR引入突变主要是在引物上“做手脚”。（但注意，引物3‘末端的碱基必须互补配对！）
在引物上添加一段序列即可获得插入突变。这时候需要注意，对于表达序列，插入碱基的数目一定要是三的倍数，否则会造成阅读框移码。在引物上替换几个碱基也可以引入突变，一般用于表达产物的氨基酸突变。此外，还需要提防改造后的引物匹配到模版中的其它位置。这里可以提前用blast预测看看。
限制性酶切和连接是最常见的载体构建方法。利用限制性内切酶对DNA序列和载体质粒进行酶切，暴露出相同的黏性末端或者平末端，再利用DNA连接酶（一般是T4 ligase）进行连接。
由于限制耐逗性酶切和连接的方法依赖限制性内切酶的使用，构建成功与否取决于目的DNA和载体序列上是否存在合适的酶切位点以及对应的酶。因此开发出无缝克隆的技术，不依赖限制性内切酶，使得克隆更昌虚卖加便捷，应用范围更广。
Gateway Cloning，翻译成门途径克隆，是由invitrogen公司研发的技术，目前经过多轮收购，属于Thermo公司。Gateway的核心是利用λ噬菌体位点同源重组。
目的基因和载体基因ccdB的序列两段带有 att X 序列，这个 att X 可以看作是同源重组的“信号序列”，分为 "att B"、"att P"、"att L"、"att R" 四种。其中 "att B" 和 "att P" 通过BP重组酶进行交换（BP反应）；其中 "att L" 和 "att R" 通过LR重组酶进行交换（LR反应）。
目的基因首先通过与供体质粒（Donor vector）进行BP反应，获得含有目的基因序列的克隆载体，算是“入门”。随后可以与多种目的载体进行LR反应，将目的基因置换到目的载体当中。
ccd B 是一种致死性基因，载体上表达 ccd B 时，感受态细胞无法存活，由此来清除Gateway cloning过程中的副产物。
吉布森无缝克隆誉戚是JCVI研究所的“吉布森”教授（Daniel G. Gibson）发明，利用DNA同源重组原理，比GAteway cloning更加简单，应用非常广泛，基本上各大公司都有相应的产品。
首先目的DNA和载体两段需要有15bp的同源序列。由于这段序列可以源自载体序列，通过PCR加到目的序列上，所以实际获得的拼接是无缝的。然后通过5‘外切酶是的目的序列和载体都暴露出单链DNA，形成类似于黏性末端的单链接头，退火使目的序列和载体互补配对，利用DNA聚合酶补齐末端缺失的碱基，再用DNA连接酶“缝合”切口，从而完成克隆。
看似用到多个酶的多步反应，通过混合酶或重组酶也可以Mix的体系，进行一步操作。
In-Fusion cloning是由clontech公司开发的，其原理与Gibson cloning大体相同，主要区别也是在于使用的酶，也属于专利产品。
NEB公司的高保真DNA组装与Gibson cloning的原理类似，使用的就是经过改造的重组酶，为其公司的专利产品。可以用一步反应进行DNA组装。它的特色还在于反应中使用的酶的高保真性。
NEB公司自己就拥有上述三种克隆方法对应的产品，官网中有对它们自家的三款产品平行比较。仅供参考。
TA克隆和GC克隆是最简单，也是最“小学生”的克隆。TA克隆利用Tag酶在PCR产物3‘末端加A的特性，设计对应5‘末端加T的载体与之配对。这样PCR的产物不用经过任何处理就可以与载体进行连接，一步完成。GC克隆与之相同，是利用了另一种DNA聚合酶3’末端加G的原理，当然目前这种酶用得越来越少了，几乎是停产，所以一般没人使用了。
『陆』 基因克隆
基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。例如,要获得人类基因组中的某个基因，我们就需要借助基因克隆技术，进行目的基因的分离、克隆和扩增。因此，接下来，我就从基因克隆工具和具体的实验流程两方面进行介绍。
（ 1 ）限制性内切酶
首先介绍的是限制性核酸内切酶，它是细菌的“限制-修饰系统”防御机制的重要一员。限制修饰系统(Restriction-Modification System, R-M system )，即限制酶和甲基化酶系统（图1） [1]。研究者将能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖的酶称为 限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease，RE，简称限制性内切酶或限制酶）。而宿主细菌的DNA通过甲基化酶的甲基化后，DNA的酶切位点被保护起来，不会被限制酶切割。
根据限制性内切酶的结构，识别位点，切割位点等特性可以将RE分成四类（表1）[2]，基因克隆中常用的是II型限制性内切酶。不过像IV型内切酶这种可以识别修饰化DNA，可以用于表观遗传学的研究。
II型限制性内切酶是目前发现的最多的一类内切酶，根据其识别位点与切割位点的特性又可以分成不同的亚型[3]，例如我们常见的识别回文序列的内切酶， Eco R I，属于Type IIP类型，这种酶的切割位点在亩陪识别位点内部；而像现在在CRISPR/Cas9相关基因克隆中用到的 Bpi I等酶，则属于Type IIS型，它的切割位点离识别位点有几个到几十个碱基的距离。
既然是迅没蠢限制性内切酶，那么酶切DNA后就会留下不同的末端类型，这其中就包括粘性末端和平末端（图3）。所谓的粘性末端，就是酶切后有5’端或者3’端有突出碱基的末端类型，因此又分为5’ Overhang end，例如 Hin d III，和3’ Overhang end， 例如 Pst I两种。那些酶切后没有突出碱基的就属于平末端类型， 例如 Eco R V。
DNA碱基之间靠5’, 3’ 磷酸二酯键连接，限制性内切酶切割DNA后，出现的是5’-P 和3’-OH（图4）。
另外，根据限制性内切酶的功能，其又有同裂酶、异裂酶、同尾酶、可变酶和修饰敏感内切酶等类型（图5）。其中，同裂酶(isoschizomer)，又称异源同工酶，即从不同原核生物中分离出来的不同的Ⅱ型酶，有相同的识别特点和切割位点，例如 Age I和 Bsh T I。异裂酶则是指可以识别相同的核苷酸序列，但会在不同的位点切割 DNA，例如 Sma I和 Xma I。同尾酶(isocaudarmer)指不同来源的酶其识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产生相同的粘性末端，例如 Age I和 Xma I，这一类的酶酶切后的产物可以进行连接，在基因克隆中有着重要的用途。可变酶则指所识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个察消碱基对，例如 Bst E II识别序列为：GGTNACC，其中N为一可变碱基，可以是A/T/C/G四种中的任何一个；而 Bst N I 的识别序列为CCWGG，其中的W则表示A或者T。修饰敏感内切酶是对DNA修饰（例如甲基化修饰）敏感的限制性内切酶，例如 Bcl I对甲基化的识别位点不能切割，但无甲基化的则可以进行切割； Dpn I则刚好相反，有甲基化才能切割。
限制性内切酶有那么多种，到底选择那种进行呢？
首先，我们需要进行酶切位点分析，可以使用在线（ Sequence Manipulation Suite 和 analyze-sequence, Addgene ）或者本地版（SnapGene）的分析工具进行序列分析。然后结合同裂酶、异裂酶、同尾酶、可变酶特性进行RE选择，并且同时要考虑所选限制性内切酶对修饰敏感性。另外，根据试剂使用中使用的酶的数量，我们将酶切反应可以分为单酶切、双酶切和分步酶切。 单酶切 ：同一个体系进行一种酶切反应； 双酶切 ：同一个体系进行两种酶的酶切反应（针对反应条件一致的限制性内切酶）； 分步酶切 ：样品进行完第一个酶切反应后进行纯化，再进行第二个酶切反应（针对反应条件不一样的限制性内切酶）。明确了以上信息后，我们就可以进行酶切反应了。一个酶切反应涉及样品类型，缓冲液，酶量以及反应温度和反应时间等。这些都可以参考限制性内切酶的产品使用说明进行操作。
（ 2 ） DNA 连接酶
限制性内切酶负责将DNA切开，DNA连接酶则是用来重新连接DNA的工具。DNA连接酶是一类催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶（图6）。因为是双链，所以一般要求连接位点不能出现碱基错配。不过实际应用中，DNA连接酶也会将有少量错配的DNA进行连接。DNA连接酶主要有两种：T4 DNA连接酶（平末端和粘性末端均可连接），大肠杆菌DNA连接酶（只能连接粘性末端）。
（ 3 ） DNA 聚合酶
之前我们介绍过PCR聚合酶链式反应，其中使用的就是DNA聚合酶。实际上，DNA聚合酶长具备三种酶活性（图7）：用于新链DNA合成的DNA聚合酶活性，用于错误参入碱基校正的3’-5’核酸外切酶活性，还有5’-3’ 核酸外切酶活性，在DNA复制中用于去除RNA 引物。借助这一活性，可以进行Nick translation，用于标记核苷酸参入等。但并不是每一种DNA聚合酶都这三种酶活性，NEB官网提供了一系列DNA聚合酶及其具备的功能活性（ DNA Polymerase Selection Chart-NEB ）。
根据所使用的DNA聚合酶类型不同，PCR产物的末端有3’-A粘性末端和平末端两种类型。其中Taq DNA polymerase因为缺乏3’-5’ exonuclease活性，其PCR的保真度低，且PCR产物的3’端多一个粘性末端A；而 高保真DNA polymerase保留3’-5’ exonuclease活性，有很高的校正活性，其PCR产物为平末端。
（ 4 ）无缝克隆技术
除了上面介绍的用于传统基因克隆中国的相关工具外，研究者开发了新型的基于插入片段和线性化载体的末端进行同源重组的基因克隆技术，即无缝克隆技术（Seamless Cloning），主要包括Gibson Assembly[4]和Getway Clone两种。这里我们重点介绍其中的Gibson Assembly。
Gibson Assembly技术包含了DNA 5' 外切酶(5' Exonuclease)、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA连接酶(DNA Ligase)活性的重组酶(assembly enzyme)，通过同源重组的方法可以将一个或多个DNA片段按照预定方向、快速、高效和精确地插入到线性化载体中，并且最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列，因此被称作“无缝克隆”。如图9中Gibson Assembly所示，红色和绿色2个片段为需要连接的双链DNA片段，它们末端有相同的15-25个重叠序列（黑色），首先在50℃条件下，T5 exonuclease核酸外切酶降解5’端的一些碱基，形成3’端突出的单链，3’端单链互补退火；然后Phusion高保真聚合酶补上两条单链之间的缺口；最后Taq DNA ligase将相邻的单链切口连接补齐形成完整的DNA双链（图6）。
在Gibson Assembly基础上，研究者开发了TEDA[5]，仅添加T5 exonuclease核酸外切酶同样可以实现重组克隆，它与借助细胞体内的DNA修复机制进行缺损DNA的修复（图6）。
（ 5 ）工具载体
接下来我们介绍基因克隆中常用的工具载体。按照功能分，载体分为克隆载体和表达载体（表2）。其中克隆载体含有能在原核细胞中复制的元件，用来克隆和扩增基因；表达载体除了具备克隆载体的基本元件外，还具有转录/翻译所必须的DNA顺式元件。以下，我们将以SnapGene或addgene分析的载体结构图进行相关功能元件的说明。
以pUC19为例，说明克隆载体中的功能元件（图10）。
复制起始位点（ Origin of replication ， ORI ）： ORI是一段DNA序列，质粒复制的起始位置。DNA解螺旋酶可以作用于这段序列，然后DNA的双链被分开，复制随即开始。质粒必须是能够复制的，否则随着细菌的生长，质粒的数量将会被迅速稀释。 筛选标记，主要指抗生素抗性基因。 在含有抗生素的培养基中培养细菌，能够生长的就是含有目的质粒，因为，不含质粒的细菌已经被“杀死”了，原核中常用的抗性筛选基因有Amp和Kan。 Lac Z ：β-半乳糖苷酶基因，也是一种筛选标记，用于蓝白斑筛选。 多克隆位点（ multiple cloning site, MCS ）， 这是一段短DNA片段，包括多个限制性酶切的单一位点，便于外源基因的插入。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
以pcDNA3.1为例，说明表达载体中的功能元件（图11）。
表达载体pcDNA3.1除了有克隆载体相关元件，如复制起始位点Ori，原核筛选标记Amp外，还有一些其他的功能元件，如表3所示。
表达载体主要用于表达蛋白或者RNA，例如现在基因编辑中常用的一个表达载体PX458（图12），可以同时表达Cas9蛋白和sgRNA。因此上面也会携带一些其他的功能元件（表4）。
上面介绍的pcDNA3.1和PX458均是瞬时表达载体并不能在人类等细胞中进行复制，随着细胞的分裂，单个细胞中的质粒不断的被稀释，因此这些载体只能起到瞬时表达的效果。而慢病毒表达载体则可以介导表达元件整合到人类细胞的基因组中，这些表达元件可以随着基因组DNA的复制而复制，因此可以实现稳定表达。
我们常用的慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，将其进行收集和浓缩后可直接感染宿主细胞或者动物模型，将外源基因有效地整合到宿主的染色体上，从而达到外源基因的持久性表达。我们以pGreenPuro为例说明慢病毒表达载体中一些关键的功能元件（图13，表5）。
（6）感受态细胞
感受态细胞是采用理化方法诱导过的细胞，它可以吸收周围环境中的DNA分子。实验室中我们常使用 E. coli 进行感受态细胞的制备，主要包括克隆用的感受态细胞和表达用的感受态细胞（图14）。
如果仅仅是进行质粒扩增，我们一般使用克隆感受态细胞。如果要进行原核蛋白质表达，我们则选择表达感受态细胞。并且感受态细胞的基因型也有很多类，是通过不同基因的缺失形成的，因而使细胞具有不同的特性，以满足不同的需要。例如，进行克隆载体和瞬转表达载体的扩增，常选用 E. coli DH5α，TOP10菌株；而慢病毒载体则一般选择低重组率的 E. coli Stbl3菌株。而对于非甲基化载体的扩增，则需要选择 E. c oli dam-/dcm- 等甲基化酶缺失的菌株。
2. 基因克隆流程
前面了解了基因克隆使用的相关工具酶和载体，接下来，我们介绍基因克隆的实验流程。细分的话，包括以下10个步骤（表6）。
下面我们以lncRNA PVT1的克隆和表达，分别采用T/A克隆，传统酶切-酶连克隆和无缝克隆进行示例。
(1) T/A克隆
T/A克隆是把PCR片段与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来的方法（图15）。使用该方法进行基因克隆时不需要考虑酶切位点问题，但需要选择Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，其产物的3’端才会多一个突出的A；此外，T/A克隆选用商业化的T载体，其为线性化的载体，在3’端有一个突出的T；并且基因片段连入T载体是没有方向性的，正反都有可能。
我们首先从NCBI上获取PVT1（human）的基因序列信息（ https ://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MG562504.1 ），然后使用SnapGene等进行PCR引物设计（图16）。以PVT1全长序列（1081nt）为模板，设计的引物正向引物的5’端与PVT1序列的5’端相同，反向引物的5’端与PVT1序列的3’端互补。然后使用Taq DNA 聚合酶，以细胞的cDNA为模板进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳或割胶回收目的大小片段（图17）。
胶回收的基因片段与商业化的T载体（pMD-18T）连接，形成重组DNA载体pMD18-PVT1（图18），经转化（图19）和菌落PCR（图20）后筛选到候选阳性克隆，再使用Sanger测序（图21）进行插入序列的鉴定，获得阳性克隆。
（2） 传统酶切 - 酶连克隆
传统酶切-酶连克隆主要是采用相同的限制性内切酶（或者同尾酶）分别酶切载体和基因片段，然后使用DNA连接酶进行连接，转化。以下，我们同样以PVT1为例，将其使用传统方法克隆至pcDNA3.1表达载体上。
我们在获得PVT1的基因全长序列后，需要首先进行酶切位点分析，例如使用SnapGene进行常用6碱基识别位点的限制性内切酶位点分析（图22）。同时，我们分析pcDNA3.1中MCS中可用的酶切位点，我们排除PVT1有的限制性内切酶并排除同尾酶（避免载体的自连），即可得到可用的限制性内切酶。在这里我们选择 Nhe I和 Eco R I（图23）。
接下来，我们以PVT1的全长序列为模板设计克隆引物（SnapGene设计的引物序列与T/A克隆中一样），不过我们还要在引物的5’端添加选择好的限制性内切酶的酶切位点以及相应的保护碱基（图24）。同样使用Taq DNA 聚合酶或者其他高保真DNA聚合酶，以细胞的cDNA为模板进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳或割胶回收目的大小片段。
回收的PVT1 PCR产物和pcDNA3.1载体均使用 Nhe I和 Eco R I进行双酶切，其中PVT1由于酶切后的序列为一个约1000bp的片段和一个约5bp的片段，无需进行割胶回收，直接使用PCR产物纯化柱进行酶切产物纯化即可（图25）。而pcDNA3.1的酶切由于可能存在未完全切开的质粒（在后续转化中会形成大量的假阳性克隆），需要进行琼脂糖凝胶电泳，割取线性化的载体片段进行胶回收（图25）。然后将PVT1和pcDNA3.1酶切片段使用DNA连接酶进行连接，转化。同样，使用菌落PCR和Sanger测序进行阳性克隆子pcDNA3.1-PVT1的筛选（图26）。
（3） 无缝克隆
无缝克隆的一个重要优势是不需要考虑待克隆片段中的酶切位点情况，因此直接选择相应的酶切位点将载体线性化后，根据载体的线性化末端进行同源引物的设计，PCR扩增目的基因并纯化后直接进行重组连接和转化（图27）。以下，我们同样以PVT1克隆至pcDNA3.1载体为例进行说明。
获得PVT1和pcDNA3.1的全长序列后可以使用SnapGene，CE Design（Vazyme）和In-Fusion Clone（Takara）等在线或本地软件进行同源臂引物的设计。
使用同源臂引物，以细胞cDNA为模板，使用高保真DNA聚合酶为模板进行PCR，胶回收相应片段。pcDNA3.1载体使用 Nhe I和 EcoR I进行双酶切后，割胶回收载体片段。然后添加无缝克隆试剂进行重组连接，转化后进行阳性克隆的筛选与鉴定。
而实际上，无缝克隆还有另外一个重要的优势：可以同时进行多片段的重组克隆，而这对于传统酶切-酶连克隆是一个很大的挑战。基于传统克隆技术可能需要克隆一个片段后，再在特定位置选择酶切位点，插入第二个片段，依次推进，这样不仅实验周期长，并且会在每个片段之间引入了额外的酶切位点碱基序列，可能影响到基因的完整性。不过可以通过融合PCR的方式，设计末端重叠的引物进行各个克隆片段的融合，但长的基因片段的PCR扩增本身也存在着失败率提高的问题（表8）。
总结
本部分我们主要介绍了基因克隆中使用的工具酶和载体，并以PVT1的克隆和表达载体的构建为例，分别介绍了T/A克隆、传统酶切-酶连克隆和无缝克隆技术的实验流程。
参考文献
1. Vasu,K. and V. Nagaraja, Diverse functions of restriction-modification systems in addition to cellular defense.MicrobiolMol Biol Rev, 2013. 77 (1): p. 53-72.
2. Loenen, W.A., et al., Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes.Nucleic Acids Res, 2014. 42 (1): p. 3-19.
3. Pingoud, A., G.G. Wilson, and W.Wende, Type II restriction endonucleases--a historical perspective and more.Nucleic Acids Res, 2014. 42 (12): p. 7489-527.
4. Gibson, D.G., et al., Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat Methods, 2009. 6 (5): p. 343-5.
5. Xia, Y., et al., T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res, 2019. 47 (3): p.e15.
『柒』 什么叫DNA克隆技术
克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。
1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。
2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细肢喊空胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。
3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。
另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。
二、克隆技术
1．DNA克隆
现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例)
可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。
2．生物个体的克隆
(1)植物个体的克隆
在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞
可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程!
(2)动物个体的克隆
① “多利”的诞生
1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。
“多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下：
从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将渗握胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。
一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠
就是名副其实的克隆鼠了。
② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程
在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细历瞎胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次）
卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。
不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。
目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。
三、克隆技术的福音
1． 克隆技术与遗传育种
在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。
2． 克隆技术与濒危生物保护
克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。
3． 克隆技术与医学
在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？
克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。