什么是多片段dna无缝连接

A. DNA的片段之间有哪些连接

（1）具互补黏性末端片段之间的连接：连接反应可用emphasis：role=italicE.coliemphasis：DNA连接酶，也可用T4：DNA连接酶。待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性内切核酸酶酶切的，连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。如果是用两种同尾酶酶切的，虽然产生相同的互补黏性末端，可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子往往消失了原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列。

（2）具平末端DNA片段之间的连接：连接反应必须用T4：DNA连接酶。只要两个DNA片段的末端是平末端的，不管是用什么限制性内切核酸酶酶切后产生的，还是用其他方法产生的，都同样可以进行连接。如果用两种不同限制性内切核酸酶酶切后产生的平末端DNA片段之间进行连接，连接后的DNA分子失去了那两种限制性内切核酸酶的识别序列。如果两个DNA片段的末端是用同一种限制性内切核酸酶酶切后产生的，连接后的DNA分子仍保留那种酶的识别序列，有的还出现另一种新的限制性内切核酸酶识别序列。

（3）DNA片段末端修饰后进行连接：待连接的两个DNA片段经过不同限制性内切核酸酶酶切后，产生的末端未必是互补黏性末端，或者未必都是平末端，因此无法进行连接。在这种情况下，连接之前必须对两个末端或一个末端进行修饰。修饰的方式主要是采用核酸外切酶Ⅶ（exonuclease：Ⅶ，Exo：Ⅶ）将黏性末端修饰成平末端；采用末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）将平末端修饰成互补黏性末端。有时为了避免待连接的两个DNA片段自行连接成环形DNA，或自行连接成二聚体或多聚体，可采用碱性膦酸酯酶将其中一种DNA片段5′-P修饰成-OH。

（4）DNA片段加连杆后连接：如果要连接既不具互补黏性末端又不具平末端的两种DNA片段，除了上述用修饰一种或两种DNA片段末端后进行连接的方法外，还可以采用人工合成的连杆（linker）或衔接头（adaptor）。先将连杆连接到待连接的一种或两种DNA片段的末端，然后用合适的限制性内切核酸酶酶切连杆，使待连接的两种DNA片段具互补黏性末端，最后在DNA连接酶催化下使两种DNA片段连接，产生重组DNA分子。此外，也可以根据两DNA片段的末端，选用合适的衔接头直接把两DNA片段连接在一起。

B. 生物科学中的连接在DNA两端的双链接头是什么

就是人工向片段两端加的小片段DNA。接头的序列是可以自己设计的，来达到一定的目的。在抑制PCR中就是靠连接接头来达到扩增目的片段而抑制非目的片段扩增的。

C. 质粒系列之再谈无缝连接--Gibson assembly

每次都想要一篇文章的篇幅讲完，但知识总是越学越知道自己的无知，于是每次就像打补丁一样这里打一下那里打一下，导致文章都不成系列，十分松散。关于Gibson assembly其实我之前也讲过，只是都不记得放在哪一篇里了。这是最近学习的笔记。

限制性克隆所谓成也限制性，败也限制性，限制性克隆的最大的限制来源于其“限制性。Gibson assembly不依赖限制性内切酶，可一步完成多个DNA序列的组装，大大提升DNA组装速率，同时还可降低载体自连的概率，是多片段DNA序列连接的首选方式。下表简单比较两种方法的特点。

这查资料的时候发现特别有趣，原来无论是限制性克隆还是Gibson assembly，都是出自同一个实验室/机构。

左边这位 Hamilton Smith 教授是II类限制性内切酶的发现者之一，并因这一发现与Daniel Nathans和Werner Arber共同获得了1978年的诺贝尔生理学和医学奖。而右边的 Daniel Gibson 于2004年到 J. Craig Venter Institute (克雷格·文特尔研究所 )的 Hamilton Smith组做博后，负责细菌基因组合成的相关课题。而 J. Craig Venter 则因其牵头人类基因组计划而闻名，创立了 J. Craig Venter Institute 及 Synthetic Genomics Inc. ( SGI ) 公司

从2004年Gibson入职到2008年，不到4年时间，Gibson和Smith在 Science 上共同发表了酵母细胞完成支原体基因组组装的文章，而这篇文章用到的DNA片段组装方法则在2009年发表于 Nature Methods

从上图Nature Methods文章的摘要可看到，Gibson使用 5‘核酸外切酶，DNA聚合酶和DNA连接酶 完成了多DNA片段的一步连接，而这就是我们现在常用的 Gibson assembly 。

一般实验室都直接购买配好的Gibson assembly mixture，但也可自行购买T5 核酸外切酶、DNA聚合酶以及DNA连接酶配置。Gibson操作简单，具体过程和步骤都写在下图中：

需要注意的事项有：

(1) 一般说明书推荐所有片段都用PCR手段获得，但长片段会有因PCR而引入突变，因此，骨架大片段可采用限制性内切酶处理后获取。

(2) 如果两端序列中有多个同源序列，则会有错误同源重组的可能，例如Loxp序列等等。

对比限制性克隆和Gibson assembly，最大的区别是无需特定的酶切位点，然而实际上还是需要overlap的悬端，只是这个悬端可以由PCR带来，同时核酸外切酶的末端修整，使得overlap序列暴露，从而完成同源重组。那么核酸内切酶和核酸外切酶的差别和分类我们可以简单来学习一下：

从名字来看，内切酶切的是序列内部，外切酶切的则为外部（5’或3‘末端），具体的比较可如下表：

两种方法自是各有优缺，虽目前多用Gibson assembly，但限制性克隆仍然常用。限制性内切酶种类繁多，其中Type IIS克隆更是被称为 Golden Gate cloning 。从操作时间来看，Golden Gate是最简单的方法之一，单管内酶切和连接可在30分钟内完成。由于Type IIS酶切不保留酶的识别位点，因此连接产物的形成是不可逆的，连接效率几近100%。且Golden Gate 克隆限制性克隆需分步完成的缺点，在同一管内可完成多达10个片段的连接，果子老师称之为-- 质粒改造的王者 。下周，我们将会聊聊这 Golden Gate cloning ，敬请期待。

D. chew back啥意思

不知道是不是DNA连接方面的，Chew-back是一种DNA的组装方式。
单链退火拼接技术，即所谓的Chew-back组装，是指创造DNA分子之间的重叠区，通过连接或聚合的思想实现分子间的拼接。这种技术既跳出了限制酶的使用，利用DNA外切酶产生了较长的黏性末端；又应用等级化组装模式很好地规避了逐级添加的耗时耗力与一次性组装可能不正确的拼接，使得无论在组装的DNA片段数目还是尺度上变得更为高效。例如目前最常用的Gibson
assembly和SLIC技术。
在2008年，Gibson等在构建生殖道支原体基因组时，首先采用自创的体外变温两步组装法获得了支原体1/4大小基因组，然后对该技术进行改进，将这4个超过100
kb的片段在体外组装成了完整的583 kb的生殖支原体基因组。2010年，Gibson研究组又通过条件优化将600个带有20 bp重叠序列的60
bp的寡核苷酸在体外成功人工组装合成了16.3 kb的小鼠线粒体基因组。

由此可见，Gibson拼接技术可以简单快速地实现多个DNA片段的一次性无缝组装，而且组装尺度非常可观，现已成功组装的最大的DNA分子大小为1.08
Mb。但是随着一次组装的DNA片段的增多，其效率和正确率也会随之降低，而且需要的重叠序列也较长，引物合成的费用也相应增加。
SLIC是一种不依赖于序列和连接反应的克隆方法，主要利用T4
DNA聚合酶在无dNTPs存在的情况下发挥3′→5′核酸外切酶活性，将DNA片段消化产生含有末端重叠序列的5′黏性末端，然后DNA片段之间或DNA片段与载体之间依靠重叠序列退火(Rec
A可提高重组效率)，形成环状中间体，最后直接转化大肠杆菌感受态细胞，利用大肠杆菌本身的修复系统修复成完整的环状重组质粒
。2009年，美国哈佛医学院的StephenElledge研究组利用SLIC实现了9个含40 bp末端重叠序列的DNA片段(275-980
bp)的一步拼接。
SLIC拼接法不需要连接酶，也不需要考虑插入的DNA片段本身的序列，可以实现多个DNA片段的一次性组装，是构建生物合成途径的一个有效技术。目前，国外许多公司已经将其商业化，例如Novagen公司的RadianceTM系统和Invitrogen公司的GatewayTM系统都是基于此技术开发出来的。相对于上述Gibson
assembly技术而言，SLIC只需要一种酶(T4 DNA聚合酶)即可完成多片段组装，而Gibson
assembly则需要T5核酸外切酶、DNA聚合酶及Taq连接酶的协同作用。但是该技术只能组装中等尺度的DNA片段，而Gibson
assembly则可以组装高达580 kb的DNA大片段。

此外，In-FusionTM Cloning也是一种与SLIC类似的不依赖于连接反应的组装技术，不同的是In-FusionTM
Cloning使用的是一种功能类似的牛痘DNA聚合酶而非T4 DNA聚合酶，而且它只需要15 bp的重叠序列，而SLIC则需要至少40 bp的重叠序列。目前Gibson有商业化的试剂盒。
详细内容可见网址：
http://journals.im.ac.cn/html/wswxtbcn/2015/11/tb15112229.htm

E. 到底什么是DNA片段

DNA是遗传物质，它主要以DNA链的形式存在，被水解之后会得到很多大小不一的片段，就称为DNA片段。
由A、T、C、G是四种组成DNA的脱氧核苷酸。

F. 如何设计无缝克隆法能将同时两个dna片段插入载体的引物

目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下.
5,mRNA的富集方法
典型的哺乳动物细回胞含有10,000-30,000种不同的答mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝.
mRNA的丰度与文库克隆子数的关系
ln(1-P)
N= ln(1-1/n)
N: 所需克隆数; P: 要求的概率; n:一种mRNA在总mRNA中的相对比例
1) 按大小对mRNA进行分级分离
* 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好,但从凝胶中回收的得率较低.
* 蔗糖梯度离心:加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等,再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.

G. DNA连接酶的连接手段

目前已知有三种方法可以用来在体外连接DNA片段：
第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；
第二种方法是，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；
第三种方法是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。
粘性末端DNA片段的连接
DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。
平末端DNA片段的连接
常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。
同聚物加尾法
这种方法的核心部分是，利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能。末端脱氧核苷酸转移酶是从动物组织中分离出来的一种异常的DNA聚合酶，它能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH基团上。由核酸外切酶处理过的DNA，以及dATP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3′-OH末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸。这样的延伸片段，称之为poly（dA）尾巴（图2-7）。反过来，如果在反应混合物中加入的是dTTP，那么DNA分子的3′-OH末端将会形成poly（dT）尾巴。因此任何两条DNA分子，只要分别获得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。这种连接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴连接法（homopolymertail-joining），简称同聚物加尾法。
衔接物连接法
所谓衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。衔接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是我们便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。
DNA接头连接法
DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。实际使用时对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，可避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间发生彼此间的配对连接。

H. 基因片段用什么拼接怎样拼接

粘性末端法,又称限制性内切酶酶切法。要求两种DNA分子具备同一个限制性内切酶切点,能产生互补的粘性末端。主要缺点是较难选择重组质粒,而且当外源DNA片段的长度超过载体DNA较多时,形成的重组质粒的转化率较低

I. 如何拼接DNA序列

用DNA连接酶将双链DNA分子片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，当磷酸二酯键恢复后，氢键会自动形成。
E·coli-DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来。T4-DNA连接酶可以缝合两种末端（黏性末端和平末端），但连接平末端之间的效率较低。
（注：部分资料摘自《直通高考》）